Martha Botet García,1 Caridad Margarita García Peña,2 Jacqueline Aylema Romero,3 Caridad Rodríguez4 y Vivian Martínez Espinosa5
Se desarrolló y validó un método analítico alternativo para el control de la calidad del colirio de pilocarpina por espectrofotometría ultravioleta, ya que este método resulta más rápido, sencillo y económico. Además, se validó el método analítico reportado para el estudio de estabilidad por cromatografía líquida de alta resolución. Ambos métodos se compararon estadísticamente y resultaron específicos, lineales, precisos y exactos en el rango de concentraciones estudiadas.
Palabras clave: Pilocarpina, cromatografía líquida de alta resolución, espectrofotometría ultravioleta.
El clorhidrato de pilocarpina es una amina terciaria, parasimpaticomimética que estimula directamente los receptores colinérgicos. Produce la contracción del músculo esfínter del iris, da lugar a la constricción del músculo pupilar (miosis); constricción del músculo ciliar (acomodación), lo que provoca el aumento de la acomodación y una reducción de la presión intraocular, asociada con un incremento del flujo de salida y un decremento del flujo de entrada del humor acuoso. Además también puede inhibir la secreción del humor acuoso.1
La espectrofotometría ultravioleta es un poderoso instrumento en una variedad de problemas analíticos. Aunque en muchas oportunidades tiene el inconveniente de la falta de especificidad, debido a la interferencia con los productos de degradación, los cuales en ocasiones pueden presentar un espectro idéntico al componente sin degradar, y en otras las concentraciones a determinar son muy pequeñas y están por debajo del límite de sensibilidad del método o dentro de su error experimental.2
La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) le brinda la posibilidad al analista de emplear esta herramienta para solucionar los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos en los estudios de estabilidad, pues además de presentar una alta sensibilidad y exactitud, es en esencia un método separativo, lo que permite medir con gran selectividad el compuesto deseado, siempre y cuando se encuentre un sistema cromatográfico que asegure una adecuada separación.3
La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas de que el método es lo suficientemente fiable para producir el resultado esperado.4-6
Los parámetros analíticos que pueden ser considerados en la validación de un método analítico, según se expresa en la United States Pharmacopoeia (USP 26, USP 27), son exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, tolerancia y robustez.
El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un método analítico alternativo para el control de la calidad del colirio de pilocarpina y su validación. Además, demostrar si existen diferencias significativas entre el método desarrollado y el reportado en la Farmacopea de los Estados Unidos, USP 27, previamente validado.
Las muestras del colirio de pilocarpina al 2 %, utilizadas para el desarrollo de este trabajo fueron identificadas como lote 2004, fabricado en la Empresa Farmacéutica “Julio Trigo”.
En el ensayo se empleó un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 215 nm, un dosificador de 20 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realizó isocráticamente sobre una columna hypersil ODS, longitud de 25 cm, diámetro interno 4 mm y tamaño de partículas 5 μm. La fase móvil utilizada consistió en una mezcla desgasificada de KH2PO4 0,02 M, Acetonitrilo (88:12) con una velocidad de flujo de 1,5 mL/min.
Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizó la sustancia de referencia química del clorhidrato de pilocarpina (de calidad USP, con 100 % de pureza), el placebo y una muestra del producto terminado sometida a condiciones drásticas como: hidrólisis ácida HCl 0,1 N e hidrólisis básica, almacenada a una temperatura de 70 oC durante 21 días.
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con soluciones patrón de clorhidrato de pilocarpina en un rango de concentraciones de 48 a 112 µg/mL, que representan del 60 al 140 % de la concentración teórica del principio activo en la solución.
Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 6 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 días diferentes para comprobar la precisión intermedia del método.
En el estudio de la exactitud se empleó el método de recuperación; se prepararon muestras con diferentes niveles de clorhidrato de pilocarpina que representan el 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en la solución, según la formulación propuesta. Con el objetivo de verificar la relación lineal de la respuesta analítica con respecto a los diferentes niveles de concentración utilizados, se realizó el estudio de linealidad a través de los coeficientes de variación de los factores de respuesta CVf, los cuales deben ser menores que el 5 %. Además se realizó la prueba de proporcionalidad, para lo cual se utilizó el estadígrafo t Student, con el objetivo de demostrar la proporcionalidad de la señal obtenida. También se determinó la influencia del factor concentración en la variabilidad de la respuesta obtenida, a través de la prueba de Cochran (G calculada debe ser menor que G tabulada).4-6
En el desarrollo del método analítico por espectrofotometría ultravioleta se utilizó un espectrofotómetro Spectronicâ GénesisTM 2PC. Para la selección adecuada de la longitud de onda a utilizar, se realizaron previamente espectros UV, en la zona de 200 a 400 nm, con la sustancia de referencia, producto terminado, placebo y materia prima del clorhidrato de pilocarpina, disueltos en agua destilada; se observó un máximo de absorbancia a 215 nm.
La solución de referencia se obtuvo disolviendo el clorhidrato de pilocarpina, sustancia de referencia, en agua destilada hasta obtener una concentración de 20 mg/mL aproximadamente.
En la preparación de la solución de ensayo para la valoración se disolvió una alícuota de la muestra del colirio en agua destilada hasta una concentración de alrededor de 20 mg/mL. Se lee a 215 nm contra un blanco de agua destilada.
Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se emplearon muestras con la sustancia de referencia química del clorhidrato de pliocarpina, placebo, muestra de producto terminado pilocarpina colirio y muestras sometidas a condiciones drásticas de hidrólisis ácida y básica, realizando un scanning de las soluciones entre 200 y 400 nm.
Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con solución patrón de clorhidrato de pilocarpina en un rango de concentraciones de 10 hasta 30 mg/mL que representan del 50-150 % de la concentración teórica del principio activo en la solución.
Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 6 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 días diferentes para comprobar la precisión intermedia del método; para el estudio se utilizaron los estadígrafos F-Fischer y t-Student, con el objetivo de determinar la existencia de diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por ambos analistas y entre las medias obtenidas, respectivamente. Primeramente, se realizó la prueba de Fischer y se verificó la homogeneidad de las varianzas alcanzadas por diferentes analistas; se debió obtener un valor calculado menor que el tabulado. En el caso del estadígrafo t-Student se debe obtener también un valor calculado menor que el tabulado.
En el estudio de la exactitud se empleó el método de recuperación, para lo cual se prepararon muestras con diferentes niveles, que representan el 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en la solución.
La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método. Como se observa al comparar la señal obtenida para la sustancia de referencia (I) y la muestra de pilocarpina clorhidrato (II), existe similitud en cuanto al tiempo de retención. En el cromatograma correspondiente al placebo (III) no se obtuvo ninguna señal en la zona de interés, lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solución no interfieren en la determinación del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drásticas; se observan en los cromatogramas (IV, V) la aparición de picos secundarios, atribuibles a un posible producto de degradación, el cual no interfiere en la determinación del principio activo.
Fig. Resultados del estudio de especificidad del método cromatográfico. I-Cromatograma de la sustancia de referencia química. II- Cromatograma del producto terminado (muestra). III- Cromatograma del placebo. IV- Cromatograma de la muestra degradada por hidrólisis ácida. V- Cromatograma de la muestra degradada por hidrólisis básica.
Simultáneamente se realizó un scanning al pico correspondiente al principio activo en un rango de 200 a 400 nm, para una pureza del 99,5 %.
En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la exactitud. Los resultados del estudio de precisión del método desarrollado aparecen reportados en la tabla 2.
Tabla 1. Resultados del estudio de la linealidad del sistema y exactitud
| Parámetros | CLAR | UV | Límites |
| ]]>
Linealidad del sistema | y= 0,30663 X + 2,018 | y= 23,677 x + 0,00193614 | y= a x + b |
| CVf= 0,94 % | CVf = 1,13 % | CVf ≤ 5,0 % | |
| tcalc= 2,03 | tcalc= 2,99 | ]]> tcalc < ttab | |
|
Exactitud
| y= 1,14589 x - 0,89245 | y = 0,999788 x + 0,0138373 | y= a x + b |
| CVf= 1,58 % | ]]> CVf= 2,17 % | CVf ≤ 5,0 % | |
| R= 99,28 % | R= 99,70 % | R= 98,0 – 102,0 % | |
| tcalc = 1,69 | tcalc= 1,77 | tcalc < ttab | |
| Gcalc= 0,5879 | Gcalc= 0,8709 | ]]> Gcalc < Gtab |
Tabla 2. Resultados del estudio de la precisión del método analítico por CLAR
| Analista 1 | Analista 2 | ||
| Día 1 | Día 2 | Día 1 | Día 2 |
| 103,5 % | ]]> 102,2 % | 102,8 % | 102,9 % |
| 102,8 % | 102,0 % | 102,7 % | 102,5 % |
| 102,5 % | 102,1 % | 103,8 % | ]]> 102,4 % |
| 102,5 % | 102,0 % | 102,5 % | 103,6 % |
| 103,0 % | 102,4 % | 102,8 % | 103,0 % |
| 103,0 % | ]]> 102,4 % | 103,0 % | 102,6 % |
| CV = 0,33 % | CV = 0,16 % | CV = 0,40 % | CV = 0,39 % |
| Fcal= 2,52 Ftab (10,10 / 0,05)= 2,97 | |||
Los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método realizado a 215 nm, al placebo, la sustancia de referencia química, y el colirio de pilocarpina se muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Estudio de especificidad por espectrofotometría ultravioleta
]]>| Muestra | Absorbancia (310 nm) | ||
| Placebo | 0,002 | 0,003 | 0,003 |
| Sustancia de referencia química de clorhidrato de pilocarpina | 0,410 | 0,403 | ]]> 0,405 |
| Colirio de pilocarpina 2 % | 0,406 | 0,399 | 0,404 |
En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la exactitud, mientras que los resultados correspondientes a la precisión aparecen en la tabla 4.
Tabla 4. Resultados del estudio de la precisión por espectrofotometría
| Analista 1 | Analista 2 | ||
| ]]> Día 1 | Día 2 | Día 1 | Día 2 |
| 99,7 % | 99,8 % | 100,7 % | 99,3 % |
| 99,6 % | 98,9 % | ]]> 98,7 % | 99,6 % |
| 99,9 % | 100,8 % | 99,4 % | 100,5 % |
| 100,5 % | 100,8 % | 99,9 % | 100,9 % |
| ]]> 100,9 % | 101,7 % | 100,9 % | 98,1 % |
| 101,9 % | 99,7 % | 101,2 % | 99,6 % |
| CV= 0,80 % | CV= 0,90 % | ]]> CV= 0,88 % | CV= 0,98 % |
| tcal= 1,79 | Fcal= 2,45 | ||
Leyenda: CV: coeficiente de variación; t: estadígrafo t-Student; F: estadígrafo F-Fischer.
Los resultados de la comparación estadística de los resultados obtenidos por CLAR y el método analítico desarrollado por espectrofotometría ultravioleta se aprecian en la tabla 5.
Tabla 5. Comparación estadística de los métodos por CLAR y UV
| CLAR | Espectrofotometría | ]]> Límites |
| 102,9 | 100,5 |
CVf ≤ 5,0 % |
| Media= 101,5% | Media= 101,4 % | |
| Tcal = 1,98 | ||
A alternating and analytical method was developed and validated for quality control of Pilocarpine eyedrops by UV spectrophotometry, since this method is more fast, simple, and cheap. Also, for stability study by high performance liquid chromatography, reported analytical method was validated. Both methods were statistically compared, and were specific, linear, accurate, and in the rank of study concentrations.
Key words: Pilocarpine, high performance lilquid chromatography, UV spectrophotometry.
1. Martindale W. The extra Pharmacopoeia 28th ed. London: Pharmaceutical Press; 1989. p. 1224-6.
2. Cromatografía en la Química Clínica. HPLC en Reactivos Merck. Alemania. 1988. p. 3-16.
3. Quattrocchi OA, Laba RF. Introducción a la HPLC en Aplicación y práctica. Buenos Aires: Ed. Artes Gráficas Farro SA; 1992. p. 106-22; 284; 302-28.
4. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Validación de Métodos Analíticos. Sección Catalana de AEFI. Comisión de normas de buena fabricación y control de la calidad. Sept. Barcelona: AEFI; 1999. p. 1-94.
5. United States Pharmacopoeial Convention, USP 23-NF 17. Validation of compendial methods. 23 ed. Rockville; Mack Printing; 1995. p. 1982- 4.
6. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, Geneva, 1996. ICH harmonized tripartite guideline. Methodology of validation of analytical method. Recomendado en nov. 1996. Geneva: ICH; 1996.
Recibido: 8 de enero de 2007. Aprobado: 9 de febrero de 2007.
MC. Martha Botet García. Empresa Laboratorio Farmacéutico "Julio Trigo". Avenida Independencia km 7.5, Boyeros, La Habana, Cuba. Correo electrónico: caridad@cidem.quimefa.cu