Fig. 1. Constante de letalidad para B. subtilis contra desinfloor 2 %.
Lena Carolina Echeverri Prieto,1 Gloria Clemencia Cifuentes Orjuela,1 José Manuel Granados Ramírez,2 Janeth Arias Palacios3 y Cindy Fernández López1
Para evaluar la actividad desinfectante de cada agente químico se implementó una metodología cuantitativa por medio de la neutralización de estos con el medio Dey-Engley y recuperar las células viables después de cada ensayo y calcular la cinética de desinfección la cual es expresada como coeficiente de letalidad (k). Se observó que este valor era inversamente proporcional al tiempo de contacto para los tratamientos con B. subtilis frente a todos los desinfectantes, y para A. niger con el alcohol etílico al 70 %, el amonio cuaternario catiónico y el hipoclorito de sodio.
Palabras clave: Cinética de desinfección, glutaraldehído, hipoclorito de sodio, amonio cuaternario, hipoclorito de sodio, alcohol etílico.
La función de un desinfectante es destruir microorganismos en suspensión y prevenir la diseminación de estos. Por esto los desinfectantes son usados en muchas y diversas condiciones, contra microorganismos en suspensión y en las superficies de objetos inanimados, y difieren en los periodos de actuación.1 Teniendo en cuenta esto, y que la desinfección no tiene lugar instantáneamente, pero sí es un proceso gradual, Chick, al examinar los resultados de Kroing y Paul en 1887 acerca del coeficiente fenólico, descubre que el logaritmo del número de las bacterias sobrevivientes estaba directamente relacionado con el tiempo que estaban sometidas al tratamiento y luego de hacer una representación gráfica de los datos, los puntos formaban una línea recta. Estas observaciones se confirmaron cuando hizo sus experimentos en la desinfección de esporas de ántrax con fenol y cloruro de mercurio, y para verificar esto aplicó un modelo matemático con el fin de seguir la cinética de desinfección.2 Sin embargo, diversos factores influyen en los métodos de evaluación de los desinfectantes, por lo que para realizar una correcta evaluación de estos es necesario emplear las mejores condiciones posibles, con el fin de poder obtener datos que proporcionen una alta confiabilidad. Por lo tanto, hay que tener en cuenta 2 factores importantes que podrían influir en el éxito de la evaluación: la selección del cultivo microbiano y su mantenimiento como la elección del medio de cultivo. La efectividad de un proceso de desinfección puede ser máxima teniendo en cuenta los factores siguientes: seleccionar un desinfectante apropiado para el microorganismo que va a ser inactivado. Si no se sabe que microorganismo es, se puede seleccionar un agente con amplio espectro de actividad como sea posible. Reducir el contenido orgánico al mínimo en las superficies u objetos a desinfectar. Tener en cuenta que la mayoría de los desinfectantes químicos tiene actividad limitada contra las esporas. Usar el desinfectante en la concentración apropiada, ya que inadecuadas concentraciones pueden resultar en la falta de desinfección y altas concentraciones puede causar problemas de toxicidad y efectos en los materiales tratados. Cuidadosamente considerar el tiempo de exposición o tiempo de contacto necesario para la desinfección, como las concentraciones empleadas y los tiempos usados en el laboratorio pueden variar de las recomendadas por los fabricantes. La eficacia del desinfectante seleccionado puede ser validada por el usuario.3
Microorganismos: Los microorganismos que se utilizaron para este estudio fueron Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 9341, Aspergillus niger ATCC 16404 y Bacillus subtilis ATCC 21556. Se utilizó el medio Plate Count para el mantenimiento y la numeración de los microorganismos viables, y se incubaron a 35 ± 2 °C para S. aureus, E. coli, y B. subtilis; a 22 ± 2 °C para C. albicans y A. niger. El tiempo de incubación fue de 24 h, con excepción para el hongo que fue de 10 días.
Desinfectantes: Las soluciones desinfectantes evaluadas incluyen en sus formulaciones un glutaraldehído (desinfloor), un amonio cuaternario (sanivec), hipoclorito de sodio (decol-NV), una formulación con alcohol etílico al 56 % con fenoles (desinmur) y alcohol etílico al 70 %. Todas las soluciones se prepararon según las recomendaciones de los fabricantes.
Inactivación de los desinfectantes: La neutralización de los agentes químicos activos de las soluciones desinfectantes se procedió con el medio Dey-Engley (D/E), como lo describe Terleckyj y Axler.4
Evaluación de la acción biocida de los desinfectantes: Primeramente se determinó la concentración inicial de microorganismos, sembrando por triplicado 0,1 mL de la suspensión de cada uno haciendo diluciones en base 10 antes de iniciar los ensayos. Para establecer las UFC viables del hongo, se lavó la superficie del cultivo de 10 días con solución salina estéril, luego el lavado se llevó a tubos estériles, estos se agitaron de 2-3 min y se centrifugaron por 15 min a 5 ± 1 °C y 3 000 rev/min. El precipitado se resuspendió en solución salina estéril con un volumen final de 8 mL. Se inocularon las placas con 0.1 mL de la suspensión en diluciones base 10 hasta 10-5. Todas las diluciones se llevaron a incubar a 22 ± 1 °C y se observaron diariamente durante 10 días. Las suspensiones se conservaron a -4 ± 1 °C, lo cual permitió mantener las UFC/mL del hongo durante la evaluación.
La evaluación de los desinfectantes se realizó tomando tubos estériles, los cuales tenían 3,75 mL de cada desinfectante y para el control se utilizó agua destilada estéril. Se inoculó cada tubo con 0,25 mL de la suspensión inicial del microorganismo; a partir de este momento se empezaron a cronometrar los tiempos de evaluación establecidos para cada microorganismo (C. albicans, S. aureus y E. coli: 5, 10 y 15 min; B. subtilis: 15, 30, 45 y 60 min y A. niger: 15, 30 y 60 min); al finalizar cada tiempo se adicionaron según cada desinfectante el volumen de neutralizante D/E correspondiente. Se centrifugaron los tubos a 3 000 rev/min durante 15 min a 5 ± 1°C, se descartó el sobrenadante y el botón de células se resuspendió en 1 mL del medio D/E 1X, se agitaron los tubos y se inoculó el medio Plate Count con 0,1 mL de cada muestra por triplicado. El procedimiento anterior se repitió a los 7 y 15 días de preparadas las soluciones de los diferentes desinfectantes; su efectividad se evaluó durante el tiempo de almacenamiento.
Cinética de desinfección: La ley de Chick-Watson ha sido usada para definir el grado de desinfección con respecto a los microorganismos empleados para el ensayo, con la ecuación:
log10 (No/N) = k * C * t
donde:
No: concentración inicial de microorganismos
N: concentración final de microorganismos después del tratamiento con la concentración del desinfectante C, después de un tiempo t
k: susceptibilidad o coeficiente de letalidad del microorganismo.5
Acción biocida de los desinfectantes: luego de los tratamientos con los diferentes tiempos de contacto y los desinfectantes, se obtuvo que hubo una reducción total de las poblaciones microbianas de C. albicans, S. aureus y E. coli con los 5 desinfectantes de evaluación, lo mismo se apreció hacia A. niger con el desinfloor y el desinmur. Esto no sucedió con B. subtilis en ninguno de los tratamientos durante los días de almacenamiento evaluados, sin embargo la reducción que existió oscila entre el 57-99 % hablando en mortandad.
Fig. 1. Constante de letalidad para B. subtilis contra desinfloor 2 %.
Fig. 2. Constante de letalidad para B. subtilis contra decol-NV 0,45 %.
Fig. 3. Constante de letalidad para B. subtilis contra desinmur 100 %.
Fig. 4. Constante de letalidad para B. subtilis contra alcohol 70 %.
Contra C. albicans, S. aureus y E. coli la cinética de desinfección es cero ya que en todos los tiempos de contacto con los 5 desinfectantes evaluados la mortalidad fue del 100 % y el modelo matemático no es aplicable, pero se puede inferir que la actividad de este desinfectante permanece a través del tiempo de almacenamiento contra estas poblaciones microbianas, lo mismo se observó con el desinfloor 2 % contra A. niger.
Es importante resaltar que el desinfloor tiene como principio activo el glutaraldehído y este agente químico actúa sobre las membranas externas de los microorganismos e inhibe la actividad de la enzima deshidrogenada, lo que favorece la lisis celular.6
Asimismo, se logró evidenciar que los 5 microorganismos usados para la evaluación son susceptibles a la acción del cloro, el cual tiene como mecanismo de acción inhibir enzimas esenciales, al oxidar los grupos tiol (S-H), también puede producir cambios en la permeabilidad de la membrana celular.7
Al calcular la constante de letalidad para B. subtilis se observa que el valor es inversamente proporcional al tiempo de contacto y esto se debe a que el número de sobrevivientes va disminuyendo por la actividad del desinfectante que se mantuvo constante durante los 15 días de almacenamiento excepto para el desinmur y el alcohol etílico. Sin embargo, un aspecto importante a tener en cuenta que bajo condiciones de uso normales se debe tener en cuenta, resulta la influencia de factores como el contenido de materia orgánica; de hecho, la eliminación de la materia orgánica en superficies contaminadas es determinante para lograr una alta efectividad de un desinfectante, aun cuando este tenga un elevado porcentaje de efectividad.8
La constante de letalidad para A. niger solo se calcula para los días 7 y 15 de almacenamiento con el alcohol etílico porque el número de sobrevivientes fue nulo en el día cero y por lo tanto la constante es cero. También se calculó la constante para el decol-NV y el sanivec, y se pudo comprobar que su efectividad se mantuvo durante el tiempo de evaluación.
Key words: Disinfection kynetics, glutaraldehyde, sodium htpochlorite, quaternary ammonium, ethyl alcohol.
1. Entis P. Protecting the Environment. Chapter 7. In: Food Microbiology-The Laboratory. Washington: Food Processors Institute; 2002. p. 129-40.
2. Sykes G. Chemical Disinfectants. Part V. In: Disinfection and Sterilization. 2 nd ed. Londres: Ed. Chapman & Hall. 1965. p. 311-426.
3. Gerhardt P. Methods for general and molecular bacteriology. Washington, DC: American Society for Microbiology; 1994. p. 726-729.
4. Terleckyj B, Axler DA. Quantitative assay of fungicidal activity of disinfectants. Antimicrob Agents Chemother. 1987;31(5):7948.
5. Le Dantec C, Duguet J, Montiel A, Dumoutier N. Chlorine disinfection of atypical mycobacteria isolated from a water distribution system. Appl Environ Microbiol 2002;68(3):1025-32.
6. Cotrino V. Desinfectantes y procesos de desinfección. Aspectos químicos, técnicas de valoración y legislación del uso de desinfectantes en la industria colombiana En: Memorias del Seminario de Residuos Químicos en Alimentos. Bogotá: Instituto Colombiano Agropecuario; 2003. p. 11-7.
7. McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: Activity, Action and Resistance. Clin Microbiol Rev. 1999;12(1):147-79.
8. Bartumeu R, Cepero O, Castillo J, Perez S. Evaluación de la efectividad de un desinfectante derivado del grupo de los amonios cuaternarios para el enfrentamiento a los desastres biológicos. Revista Electrónica de Veterinaria REDVET 2005;VI(3). Disponible en: www.veterinaria.org/revistas/redvet
]]> Recibido: 8 de enero de 2007. Aprobado: 9 de febrero de 2007.1 Microbióloga Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.
2 Químico Farmaceuta. Director Departamento de Control de Calidad. Empresa Colombiana de Productos Veterinarios, VECOL SA.
3 Master en Ciencias. Bacterióloga. Grupo de Biotecnología Industrial y Ambiental. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.