PRODUCTO NATURAL
Efecto de Phyllanthus orbicularis sobre la viabilidad celular y el antígeno de superficie de la hepatitis B en células PLC/PRF/5
Effect of Phyllanthus orbicularis on the cell viability and the hepatitis B surface antigen in PLC/PRF/5 cells
Annele Roque Quintero,I Iriam Salazar Gutiérrez,II Luis Morier Díaz,III Gloria del Barrio AlonsoIV
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I Máster en Microbiología. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
II Licenciado en Microbiología. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
III Máster en Microbiología. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". La Habana, Cuba.
IV Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Titular. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. La Habana, Cuba.
RESUMEN
La actividad antiviral de Phyllanthus orbicularis Kunth, planta endémica de Cuba, frente al virus de la hepatitis B, fue estudiada in vitro. Se determinó la capacidad del extracto acuoso y 2 fracciones químicas ricas en taninos y flavonoides (acético-acuosa y butanólica) para inhibir la producción o bloquear la detección del antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB) en las células PLC/PRF/5, una línea celular de hepatoma humano que expresa este marcador constitutivamente. El extracto acuoso fue efectivo al inhibir el AgsHB producido a las 24 y 48 h con índices selectivos superiores a 10, con una acción inhibitoria dependiente de la concentración. La evaluación de la actividad de las fracciones obtenidas a partir de esta planta mostró que ambas eran efectivas con índices selectivos superiores a 10. Estos resultados sugieren que existe una actividad inhibitoria del antígeno estudiado y que esta planta posee algunos compuestos fenólicos que podrían actuar sobre el AgsHB y reducir su producción en las células, lo que indica una posible actividad in vivo. Este trabajo corrobora el potencial de acción antiviral del extracto acuoso de P orbicularis, además de avalar el empleo de la línea PLC/PRF/5 para futuras evaluaciones o ensayos encaminados a valorar la actividad antihepatitis B de diferentes productos. De igual forma abre el camino para la determinación de aquel o aquellos componentes químicos responsables de la actividad de la planta frente al virus de la hepatitis B. ]]>
Palabras clave: antiviral, virus de la hepatitis B (VHB), planta medicinal, Phyllanthus orbicularisABSTRACT
The antiviral activity of Phyllanthus orbicularis, an endemic Cuban plant, against the hepatitis B virus was evaluated in vitro. The ability of the aqueous extract and 2 tannin- and flavonoid-rich chemical fractions (aqueous-acetic and buthanolic) to inhibit the hepatitis B surface antigen (HBsAg) production was determined in PLF/PRC/5 cellas, a human hepatoma cell line that constitutively expresses this antigen. The aqueous extract was effective in inhibiting the HBsAg at 24 and 48 hours of treatment, being the selective index (SI) above 10, with concentration-dependent inhibitory activity. The evaluation of the inhibitory action of the two fractions from the plant proved that both were effective and their selective indexes were also higher than 10. These results indicated the inhibitory activity against HBsAg of the plant and the presence of phenolic compounds that could reduce the antigen production. This may contribute to an in vivo antiviral action. This paper also corroborated the antiviral potential of the aqueous extract from Phyllanthus orbicularis Kunth, in addition to supporting the use of PLC/PRF/5 for future evaluations or trials directed towards assessing the anti-hepatitis B activity of various products. Likewise, it paved the way for the detection of the chemical component(s) responsible for the plant's action against hepatitis B virus.
Key words: antiviral, hepatitis B virus, medicinal plant, Phyllanthus orbicularis.
INTRODUCCIÓN
La hepatitis B constituye una de las principales enfermedades infecciosas que afectan al hombre, y es la principal causa de hepatitis crónica, cirrosis y carcinoma hepatocelular; con aproximadamente un 5 % de la población mundial como portadores crónicos del virus de la hepatitis B (VHB).1,2 Aunque se disponen de vacunas para la prevención de la enfermedad, estas no ofrecen solución al grupo de portadores del VHB a la vez que existe la posibilidad en estos individuos vacunados de la aparición de mutantes que se "escapan" del efecto protector de los antiHBs, las llamadas "mutantes de escape". Por otro lado, la terapia, fundamentalmente a base de interferón a y lamivudina, presenta inconvenientes dados por la presencia de efectos colaterales dosis-dependientes, así como la aparición de mutantes resistentes.3 Por ello el desarrollo de nuevos agentes antivirales para la terapia de la hepatitis B crónica continúa siendo un aspecto de gran importancia, ya sea de forma sintética o a partir de fuentes naturales. El empleo de plantas del género Phyllanthus ha sido descrito en la Medicina Tradicional de varios países para el tratamiento de la ictericia, de enfermedades hepáticas o como tónico para el hígado, entre otros usos.4 En Cuba existen varias especies de este género, muchas de ellas endémicas, entre las que se encuentra Phyllanthus orbicularis Kunth, cuyos extractos han mostrado la capacidad de inactivar al AgsHB en sueros humanos positivos a este marcador.5,6 También ha sido demostrada la actividad de esta planta frente a herpesvirus (Herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2).7-9 En el presente trabajo se evalúa la actividad del extracto acuoso de P. orbicularis sobre el AgsHB en células PLF/PRC/5 de hepatoma humano y de 2 fracciones químicas obtenidas de la planta.
MÉTODOS ]]>
Extracto acuoso y fracciones químicas obtenidas de P. orbicularis
El extracto acuoso empleado se obtuvo a partir de hojas y tallos de la planta (No. 7-220-HAJB), colectados en agosto en Cajálbana, Pinar del Río y procesados según del Barrio y Roque (1999). A partir de la droga cruda se obtuvieron 2 fracciones: una por extracción acético-acuosa (FAA) y la otra por extracción butanólica (FB).10 Para los ensayos in vitro se preparó una solución de trabajo de 3 mg/mL en medio de cultivo MEM (Gibco) suplementado con 1 % L-glutamina (SIGMA), filtradas con membranas de citrato de celulosa, porosidad 0,02 µm (Millipore) y conservadas a 4 °C. Para la solubilización de FAA y FB se adicionó dimetilsulfóxido (DMSO, 0,8 %) (SIGMA).
Células
La línea de células de hepatoma humano PLC/PRF/5 creció en MEM suplementado con 1 % de L-glutamina, 10 % de SBF (SIGMA) y 50 µg/mL de gentamicina, a 37 °C.
Ensayo de citotoxicidad
Las células PLF/PRC/5 se sembraron a densidad de 2 x 105 células/mL y se incubaron a 37 °C en 5 % CO2. Después de 24 h de incubación se adicionó medio fresco de mantenimiento (MEM con 1 % glutamina sin SBF) con las correspondientes concentraciones del extracto o fracciones a evaluar, y se incubaron en estas condiciones por 24, 48 o 72 h, según el ensayo. Posteriormente se añadió una solución de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromuro (MTT) en PBS a cada pocillo y las placas se incubaron a 37 °C en 5 % CO2 por 3 h. El precipitado se disolvió en 100 µL de DMSO por pocillo y la absorbancia se midió a 540 nm con longitud de onda de referencia a 620 nm en un espectrofotómetro lector de placas multipozos (MRX Revelation, Dynex Technologies). La viabilidad celular se calculó como fue descrito por Mosmann.11
Ensayos de evaluación del AgsHB
Las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una concentración de 2 x 105 células/mL en el medio de crecimiento correspondiente, y se incubaron durante 24 h. Al cabo de este tiempo las células se lavaron con PBS estéril (pH 7,0) y se trataron con diferentes concentraciones del extracto o la fracción correspondiente diluidas en medio de mantenimiento, durante 24, 48 o 72 h, según el caso. Al cabo del tiempo prefijado, se colectó el medio de cada pocillo y se conservó a 4 °C para determinar posteriormente la presencia de AgsHB mediante ELISA (ELISA-AgsHB, Girón).12
Procesamiento estadístico de los resultados ]]>
La concentración citotóxica media (CC50) y la concentración efectiva media (CE50), se calcularon mediante análisis de regresión lineal para un coeficiente de determinación mayor que 0,90, usando las curvas dosis-respuesta generadas a partir de los datos experimentales. Todos los resultados se presentan como valores medios y desviaciones estándar de 3 experimentos. En cada caso se calculó el índice selectivo (IS= CC50/CE50).Para la comparación estadística de los datos de CC50, CE50 y de absorbancia de los controles de células se empleó un ANOVA de clasificación simple, seguido de una prueba Duncan.
RESULTADOS
Ensayos de citotoxicidad del extracto acuoso y fracciones
El ensayo de citotoxicidad del extracto acuoso de P. orbicularis mostró un incremento de la toxicidad celular a medida que aumenta la concentración (datos no mostrados).
Los valores CC50 para los 3 tiempos de tratamiento muestran un aumento de la citotoxicidad en correspondencia con el incremento del tiempo de contacto de las células con el extracto (tabla 1). El análisis estadístico evidenció diferencias significativas (p< 0,05) entre los tiempos evaluados.
La evaluación de la citotoxicidad de las fracciones FAA y FB mostró que la primera posee un comportamiento similar al del extracto acuoso, dado por la disminución de la viabilidad celular con el incremento de la concentración de la fracción; sin embargo, la FB resultó menos tóxica con valores de viabilidad celular que oscilan entre el 80 y el 100 % para las concentraciones ensayadas (hasta 2000 mg/mL), con valores de CC50 de 1839,42 ± 78,21 µg/mL para la fracción acético-acuosa y mayor que 2 000 µg/mL en el caso de la fracción butanólica. ]]>
Ensayos de actividad sobre el AgsHBLa actividad en cultivos de células se evaluó con concentraciones subtóxicas del extracto (con una viabilidad mayor de 90 %) a los 3 tiempos de tratamiento. El extracto acuoso de P. orbicularis fue capaz de disminuir la cantidad de AgsHB producido por las células PLC/PRF/5 en los 3 tiempos de incubación. La presencia de antígeno producido es menor a medida que aumenta la concentración del extracto empleada, y se observa una disminución más brusca en el caso de las 24 h (datos no mostrados), tiempo en el que también se evidencia una cantidad de células viables significativamente menor (DO= 0,473) (p<0,05) con respecto al resto de los tiempos analizados (48 h, DO= 0,903 y 72 h, DO= 0,628) cuando se comparan los promedios de absorbancia obtenidos para los controles de células.
Los valores de CE50 para los 3 tiempos evidencian un aumento de este indicador con el incremento del tiempo de incubación. El análisis estadístico mostró diferencias significativas (p< 0,05) entre los tiempos evaluados. Los valores de índices selectivos (IS) resultaron mayores que 10 en los ensayos de 24 y 48 h de tratamiento (tabla 1).
Ensayos de actividad sobre el AgsHB de las fracciones de P. orbicularis
El ensayo antiviral se realizó de forma similar al del extracto acuoso, pero teniendo en cuenta los resultados con el extracto acuoso, se estudió el tiempo de incubación de 48 horas. Los resultados mostraron la capacidad de ambas fracciones para disminuir la cantidad de antígeno producido por las células PLC/PRF/5. Los valores de IS (tabla 2) indican que en ambas fracciones hay presencia del o de los compuestos responsables de la actividad mostrada; aun cuando para FB el hecho de no poder calcular con exactitud el valor de la CC50 impide dar un IS preciso.
DISCUSIÓN
En este estudio se reporta la actividad inhibitoria del extracto acuoso y de 2 fracciones químicas obtenidas a partir de la especie P. orbicularis Kunth frente al AgsHB producido en la línea celular PLC/PRF/5, la cual proviene de un carcinoma primario de hígado. Dichas células tienen integrada una parte del genoma del VHB y expresan la región correspondiente a las proteínas de superficie, secretando de forma permanente el AgsHB.13
El extracto acuoso de P. orbicularis mostró la capacidad de inhibir al AgsHB producido por estas células con un IS> 10, actividad que se manifiesta de forma dependiente de la concentración de extracto empleada. Estos resultados concuerdan con los obtenidos previamente en sueros de individuos positivos a este marcador,6 así como corroboran el potencial antiviral de esta planta in vitro descrito con anterioridad para los virus HSV-2 y BHV-17 y HSV-1.8,9
El hecho de presentar esta actividad frente al AgsHB (principal proteína de la envoltura del VHB) unido a la posible acción sobre uno de los pasos tempranos del ciclo replicativo de los herpesvirus,8 pudiera sugerir la existencia de un mecanismo de interacción con glicoproteínas de superficie, o sea, a nivel de la envoltura viral para los virus anteriormente mencionados. No obstante, es necesario descartar la existencia de otros mecanismos de acción intracelulares que pudieran intervenir en la inhibición de la producción de AgsHB por estas células. ]]>
De igual forma estos resultados coinciden con los obtenidos para otras especies del género, como P. urinaria14 y P. amarus15 que también mostraron un decrecimiento marcado en la producción de AgsHB en esta línea celular.Por otra parte, los ensayos realizados con 2 fracciones químicas obtenidas, una mediante extracción butanólica y la otra a través de extracción acético-acuosa, a partir de la planta, evidenciaron que la actividad manifestada por el extracto acuoso se mantiene en dichas fracciones, ambas ricas en compuestos fenólicos.10,16,17 Estos hallazgos permiten plantear que los taninos y flavonoides presentes en las fracciones sean responsables, al menos en parte, de la actividad mostrada por P. orbicularis frente al VHB.
Según Calixto y otros,18 los taninos son responsables en la acción de plantas del género Phyllanthus frente al VHB. Taninos como la geranina, el ácido elágico y la hiperina obtenidos de Geranium carolinianum mostraron capacidad para inhibir la secreción de los antígenos s y e del VHB in vitro.19 Además se ha informado por distintos autores la actividad antiviral de este grupo de compuestos frente al VIH,20,21 al HSV22 y al virus de la hepatitis C.23
Algunos flavonoides han sido descritos para el tratamiento de hepatitis virales, como la silimarina24 y la catequina.25 Otros como la robustaflavona, biflavonoide aislado de la planta Rhus succedanea,26 algunos flavonoides aislados de Lactuca indica L.,27 el sikokianin A (biflavona) y la camacromona (flavonoide), ambos obtenidos de las raíces de Stellera chamaejasme28 han mostrado potente actividad antiviral frente al VHB en cultivo de células.
Estos resultados, unidos a las propiedades antigenotóxicas, antiproliferativas y como inductor de apoptosis demostradas para el extracto acuoso de esta planta que la hacen factible como un potencial antitumoral,29 permiten vislumbrar las perspectivas de P. orbicularis en el tratamiento de la hepatitis B crónica, teniendo en cuenta la necesidad del empleo de una terapia combinada para el tratamiento de esta enfermedad, en la que pudieran incluirse, además de los compuestos sintéticos aprobados, productos de origen natural como el que aquí se evalúa para obtener una respuesta más efectiva.
Este trabajo corrobora el potencial de acción antiviral del extracto acuoso de Phyllanthus orbicularis Kunth, además de avalar el empleo de la línea PLC/PRF/5 para futuras evaluaciones o ensayos encaminados a valorar la actividad antihepatitis B de diferentes productos. De igual forma abre el camino para la determinación de aquel o aquellos componentes químicos responsables de la actividad de la planta frente al VHB.
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Recibido: 2 de mayo de 2011.
Aprobado: 18 de junio de 2011. ]]>
MSc. Gloria del Barrio Quintero. Facultad de Biología, Universidad de La Habana. Calle 25 e/ J e I, el Vedado, Plaza de la Revolución. La Habana, Cuba. Correo electrónico: gbarrio@infomed.sld.cu ]]>
