Dra. C. Yohani Pérez Guerra, MSc. Ambar Oyarzábal Yera, Dra. C. Rosa Mas Ferreiro, Téc. Sonia Jiménez Despaigne, Dra. C. Vivian Molina Cuevas

Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC). La Habana, Cuba.

RESUMEN

Introducción: el D-003, mezcla de ácidos alifáticos primarios superiores purificada de la cera de la caña, inhibe la síntesis de colesterol. Trabajos recientes han demostrado que el D-003 resulta efectivo en modelos experimentales de osteoartritis y que inhibe la actividad de las enzimas COX1 y COX2, preferentemente la COX1, sin producir gastrotoxicidad. Ha sido referido que los inhibidores duales de las enzimas COX y 5-LOX presentan efectos antinflamatorios desprovistos de gastrotoxicidad o que incluso, pueden resultar gastroprotectores. De acuerdo con estos antecedentes, el D-003 podría ser un inhibidor dual de dichas enzimas.
Objetivo: investigar el efecto in vitro del D-003 sobre la actividad enzimática de la 5-LOX, utilizando la fracción citosólica de leucocitos polimorfonucleares de ratas.
Métodos: se utilizaron las condiciones de ensayo siguientes: fracción citosólica (50 µg de proteína) disuelta en solución reguladora borato 0,2 mol/L (pH 9) y ácido linoleico (7,8-250 mmol/L) como sustrato, ensayándose muestras paralelas incubadas con Tween-20/H₂O (2 %) (vehículo), D-003 (0,6-6 000 µg/mL) o extracto de Perna canaliculus (50 µg/mL) (sustancia de referencia). Se evaluó la actividad enzimática mediante el cambio de absorbancia a 234 nm producido por la formación de dienos conjugados y medido en espectrofotómetro UV-visible. ]]> Resultados: la adición de D-003 produjo una inhibición dosis dependiente de la actividad enzimática de la 5-LOX (r= 0,975; p< 0,05) (CI₅₀= 23,06 µg/mL) in vitro. La magnitud de esta inhibición fue moderada, ya que la inhibición máxima, alcanzada a partir de 1 250 µg/mL, resultó de solo un 30 %.
Conclusiones: el estudio demuestra que el D-003 es capaz de inhibir la actividad enzimática de la 5-LOX in vitro, pero moderadamente.

Palabras clave: D-003, alcoholes alifáticos primarios superiores, inhibición de 5-LOX, lipooxigenasas.

ABSTRACT

Introduction: D-003, a mix of higher primary aliphatic acids purified from sugarcane, inhibits cholesterol synthesis. Recent studies have demonstrated that D-003 is effective in experimental models of osteoarthritis and inhibits the enzymatic activities of COX1 and COX2, mainly that of COX1, without causing gastrotoxicity. It has been mentioned that the dual inhibitors of COX and 5-LOX enzymes present with anti-inflammatory effects and no gastrotoxicity or even they can have gastroprotective actions. According to this background, D-003 could be a dual inhibitor of COX and 5-LOX enzymes.
Objective: to study the effects of D-003 on the enzymatic activity of 5-LOX in vitro, by using the cytosolic fraction of polymorphonuclear leukocytes of rats.
Methods: the following testing conditions were used: cytosolic fraction (50 µg of protein) dissolved into 0,2 mol/L borate buffer solution (pH 9) and linoleic acid (7,8-250 mmol/L) as substrate. Parallel samples were incubated with Tween-20/H₂O (2 %) only (vehicle), D-003 (0,6-6 000 µg/mL) or green-lipped mussel (Perna canaliculus) extract (50 µg/mL) (reference substance). The enzymatic activity, evaluated by the conjugated diene formation, was assessed by the absorbance changes at 234 nm (5-LOX) measured in a UV-visible spectrophotometer.
Results: by adding D-003, produced a dose dependent (r= 0,975; p< 0,05) (IC50= 23,06 µg/mL) in vitro inhibition of 5-LOX enzyme activity. The size of the inhibition was moderate, since the maximal inhibition, achieved from 1 250 µg/mL) on was only 30 %.
Conclusions: this study demonstrates that D-003 may inhibit in vitro the 5-LOX enzymatic activity, but in a moderate way. ]]> Key words: D-003, higher primary aliphatic acids, 5-LOX inhibition, lipooxygenases.

INTRODUCCIÓN

El D-003 es una mezcla de ácidos alifáticos primarios superiores purificada de la cera de caña (Saccharum officinarum L) que contiene el ácido octacosanoico (C₂₈) como principal componente, y los ácidos C₂₄, C₂₅, C₂₆, C₂₇, C₂₉, C₃₀, C₃₁, C₃₂, C₃₃, C₃₄, C₃₅ y C₃₆ en menores proporciones.¹

El D-003 inhibe la síntesis de colesterol a través de una regulación indirecta de la actividad de la enzima HMG CoA reductasa,^2,3 produciendo efectos reductores del colesterol. Estudios experimentales y clínicos han demostrado que el D-003 también inhibe la peroxidación lipídica (PL).^4-7

Trabajos recientes han demostrado que el D-003 resulta efectivo en modelos experimentales de osteoartritis,^8,9 y que inhibe la actividad de las enzimas cicloxigenasas 1 y 2 (COX1 y COX2), preferentemente la COX1,¹⁰ sin que existan evidencias de gastrotoxicidad asociadas a su uso.^4-7,8-12

Como es conocido, los efectos gastrotóxicos de los inhibidores de la COX no solo resultan de la interrupción de la síntesis de prostaglandinas (PG), sino del corrimiento concomitante del metabolismo del ácido araquidónico hacia la vía de las lipoxigenasas (LOX),¹³ produciendo leucotrienos gastrotóxicos cuya acción refuerza la causada por el déficit de PG.^14,15

Ha sido referido que los inhibidores duales de las enzimas COX y 5-LOX presentan efectos antinflamatorios desprovistos de gastrotoxicidad o que incluso, pueden resultar gastroprotectores.^16-18 De acuerdo con estos antecedentes, el D-003 podría ser un inhibidor dual de las enzimas COX y 5-LOX. ]]> Por tanto, el objetivo del presente trabajo consistió en investigar si la adición de D-003 inhibe la actividad enzimática de la 5-LOX in vitro en preparaciones citosólicas de leucocitos polimorfonucleares (PMN) de ratas.

MÉTODOS

Animales

Se utilizaron ratas Wistar machos (150-200 g) provenientes del CENPALAB (Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, La Habana), las cuales se adaptaron durante 7 días a las condiciones de laboratorio (temperatura 25 ± 2 ^o C, humedad relativa 60 ± 5 % y ciclos luz/oscuridad de 12 h), con libre acceso al agua y la comida (pienso para roedores, CENPALAB). Tras ayuno de 12 h, las ratas se anestesiaron en atmósfera de éter, se sacrificaron y los hígados se diseccionaron rápidamente con el objetivo de preparar los homogenados.

Las experiencias se realizaron de acuerdo con los principios de Buenas Prácticas de Laboratorio vigentes en la República de Cuba y los procedimientos del Centro de Productos Naturales.

Administración y dosificación ]]>
El D-003, suministrado por las Plantas de Producción de Productos Naturales (CNIC, La Habana, Cuba) fue utilizado tras corroborar su identidad y pureza con un método validado de cromatografía gaseosa,¹⁹ suspendiéndose en Tween-20/H₂O (2 %) (0,6; 4,8; 19,5; 78,1; 312,5; 1 250; 2 500; 5 000; 5 500; 6 000 µg/mL). La sustancia de referencia (extracto lipidico de Perna canaliculus, Sydney, Australia) (50 µg/mL) también se suspendió en Tween-20/H₂O (2 %).

Determinación de la actividad de la 5-LOX

Obtención de la fracción citosólica de PMN. Con este objetivo se utilizó la metodología descrita por Boyum,²⁰ para lo cual se tomó una muestra de sangre con anticoagulante (EDTA 100 µL/1 µL, se diluyó con un volumen similar de solución salina fisiológica (volumen final 10 mL) y 6 mL de esta sangre diluida se colocaron en un tubo de centrífuga. Sobre su superficie se añadieron cuidadosamente 3 mL de una solución de Nycondenz (d= 1,077 g/mL) preparada en solución amortiguadora Tris HCl 5 mmol/L; pH 7,2 y NaCl 0,44 % (p/v).

Posteriormente, este gradiente se centrifugó a 800 x g durante 30 min a 20 ^oC, en un rotor de ángulo fijo. Las células mononucleadas que aparecieron como una banda en la interfase Nycondenz-plasma se colectaron con una pipeta y transfirieron a un tubo de centrifuga más pequeño, al cual se añadió un volumen similar de solución amortiguadora PBS 50 mmol/L/EDTA 1 mmol/L, pH 7,4. Esta mezcla se centrifugó nuevamente a 400 x g durante 10 min y el sedimento obtenido se lavó con un volumen similar de solución amortiguadora mencionado. El sedimento, resuspendido en la misma solución amortiguadora, se utilizó en la preparación cruda de la enzima.

Para la obtención de la fracción citosólica se empleó la metodología descrita por Tateson.²¹ Para ello, los polimorfonucleares (PMN) se sonicaron a razón de tres ciclos de 30 s a la potencia submáxima. El homogenizado obtenido se centrifugó a 2 000 x g durante 10 min, y posteriormente el sobrenadante se centrifugó nuevamente a 100 000 x g durante 1 h y la fracción citosólica se almacenó a -20 ^oC hasta ser utilizada para determinar la actividad de la enzima 5-LOX. Todas estas operaciones fueron realizadas garantizando una temperatura de 4 ^oC.

Ensayo de la actividad de la 5-LOX

La actividad enzimática se determinó a través de la formación de los dienos conjugados mediante la lectura en espectrofotómetro (UV/Visible Genesys 10) a 234 nm.¹⁴ ]]> Las condiciones de ensayo fueron las siguientes: fracción citosólica (50 µg de proteína) disuelta en solución amortiguadora borato 0,2 mol/L (pH 9,0) y el sustrato (ácido linoleico) a concentraciones entre 7,8 y 250 mmol/L. Se utilizaron muestras controles a las que se añadió solo Tween-20/H₂O (2 %), D-003 (0,6-6 000 µg/mL) o extracto de Perna canaliculus (50 µg/mL), las cuales se preincubaron por 5 min, añadiéndose el sustrato y midiéndose los cambios de absorbancia a 234 nm cada 1 min durante 10 min. Los resultados se expresarón en mmol/min/mg proteína, y el grado de inhibición con respecto a las muestras controles.

Análisis estadístico

Las comparaciones con el control se efectuaron con la prueba de la U de Mann Whitney. El estudio de relación dosis/efecto se realizó mediante el método de regresión lineal y correlación utilizando el programa Primer of Biostatistics (Stanton A, Glantz; copyright (c) 1992, McGraw-Hill, Inc Versión 3.01).

A priori se estableció un nivel de significación a= 0,05 para la determinación de la significación estadística. Los datos se procesaron con el paquete de programas Statistic para Windows (Release 6.0, Stat Soft, Inc USA).

RESULTADOS

La tabla muestra los efectos de la adición in vitro del D-003 a la fracción citosólica de leucocitos PMN sobre la actividad de la 5-LOX. Como se observa, el D-003 produjo una inhibición dependiente de la dosis (r= 0,975; p< 0,05), no estadísticamente significativa de la actividad de la 5-LOX, que alcanzó un 31 % de inhibición, a partir de la dosis 1 250 µg/mL. En estas experiencias se utilizó el Lypirinol (50 µg/mL) como control de referencia el cual modificó la actividad de la enzima con un 88 % de inhibición.

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Como se observa, la adición de D-003 produjo una inhibición significativa, dosis dependiente de la actividad enzimática de la 5-LOX (r= 0,975; p< 0,05) (CI₅₀= 23,06 µg/mL) in vitro. La magnitud de esta inhibición fue moderada, ya que la inhibición máxima, alcanzada a partir de 1 250 µg/mL, fue de solo un 30 %. En cambio, la adición del extracto de Perna canaliculus (50 µg/mL) inhibió marcadamente (88 %) la actividad de la enzima.

DISCUSIÓN

El presente estudio demuestra que la adición del D-003 al medio de incubación (0,6-6 000 µg/mL) produce una inhibición significativa, dependiente de las dosis de la actividad enzimática de la 5-LOX in vitro, que resulta moderada.

En efecto, la magnitud de la máxima inhibición de apenas un 30 %, así como la alta concentración requerida para lograrlo, indica que el efecto del D-003 sobre esta enzima es limitado. Esta apreciación se refuerza por el hecho de que, como era esperado, la adición del extracto de Perna canaliculus (50 µg/mL), sustancia de referencia de reconocido efecto inhibidor sobre la COX y la 5-LOX,^18,22 inhibió marcadamente (88 %) la actividad enzimática, lo que confiere validez al ensayo en nuestras condiciones experimentales y por tanto, a los resultados expuestos, pero muestra que el efecto inhibitorio del D-003 sobre la 5-LOX es inferior al que produce in vitro sobre las enzimas COX-1 y COX-2, el cual alcanza inhibiciones de un 88 % y un 54 %, respectivamente.⁷ ]]> En este estudio se puede observar que a partir de la concentración de 1 250 µg/mL el efecto del extracto se hace constante ocurriendo la saturación de la enzima, lo que nos sugieren plantear como hipótesis que los componentes del extracto pudieran ejercer una inhibición de tipo competitiva sobre la enzima compitiendo con otros sustratos por el centro activo de la misma.

Aunque la inhibición de la actividad enzimática de la 5-LOX por el D-003 pudiera asociarse, al menos en parte, a su capacidad de reducir la PL en modelos experimentales en rata,^5,23 la magnitud de sus efectos antioxidantes in vivo es mucho mayor que la que debe esperarse de los efectos aquí observados. Aunque no contamos con explicación convincente para argumentar esta aparente diferencia, podría especularse que en condiciones in vitro no existen las condiciones requeridas para lograr un mayor efecto, o bien que esta enzima no es el único blanco sobre el cual el D-003 inhibe la PL. Lo moderado de este efecto, sin embargo, no limita el sustento de su eficacia en los modelos de orteoartritis,^5,6 el cual parece depender básicamente de la inhibición de COX 1 y COX2.⁷

A modo de conclusión, este estudio demuestra que el D-003 es capaz de inhibir la actividad enzimática de la 5-LOX in vitro, pero de forma moderada.

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Recibido: 23 de marzo de 2013.
Aprobado: 29 de mayo de 2013.

]]> Yohani Pérez Guerra. Centro de Productos Naturales, Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC). Calle 198 entre 19 y 21, Atabey, municipio Playa, Apartado Postal 6414, La Habana, Cuba. Correo electrónico: yohani.perez@cnic.edu.cu ]]> 1 2004 29 773-86 2 2001 44 299-304 3 2002 80 13-21 4 2003 23 193-203 5 2012 16 21-4 6 2012 7 2012 8 2000 118 31-41 9 2002 3 375-86 10 2004 30 75-88 11 2007 45 2352-8 12 2011 26 168-78 13 2004 28 18-26 14 1993 34 742-7 15 2010 333 91-8 16 2005 22 393-403 17 2005 43 247-53 18 2012 20 71-6 19 2003 31 613-20 20 1983 2 147-70 21 1988 94 528-39 22 2000 32 284-9 23 2008 58 126-30