El plasma seminal de hombres vasectomizados como medio de diseminación de bacterias
Seminal plasma from vasectomized men as a means of disseminating bacteria
Valentina Velásquez Rivera, Jenniffer Puerta Suárez, Walter Dario Cardona Maya
Grupo Reproducción Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia.
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RESUMEN
Introducción: La vasectomía es un método de anticoncepción masculina definitiva que impide el paso de los espermatozoides a través de los conductos deferentes. Sin embargo, el plasma seminal aún posee la capacidad de transportar diferentes microorganismos a sus parejas.
Objetivo: Determinar la presencia de ADN de C. trachomatis, N. gonorrhoeae, U. urealyticum, M. genitalium, M. hominis y el asilamiento por cultivo cuantitativo de bacterias aerobias en las muestras de semen de hombres vasectomizados.
Métodos: Se tomaron muestras de semen de 10 voluntarios con vasectomía y 7 sin vasectomía asintomáticos para infecciones urogenitales que fueron colectadas y evaluadas según los lineamientos de la Organización Mundial de la Salud. A cada muestra de semen se le realizó cultivo cuantitativo en agar sangre, chocolate y MacConkey. Se realizó extracción de ADN mediante la técnica de fenol-cloroformo y detección del ADN de los microorganismos mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Resultados: Se obtuvo crecimiento de algún microorganismo en las 10 muestras evaluadas, entre los cuales se encuentran Staphylococcus coagulasa negativa, Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans y Pseudomona putida. Sólo se detectó ADN de U. urealyticum en 70 % de las muestras seminales provenientes de vasectomizados y en 57 % en los voluntarios.
Conclusión: Los hombres con vasectomía pueden ser reservorios de microorganismos (inclusive microbiota) y de transportarlos hacia el tracto reproductivo femenino podría causar alteraciones importantes como infertilidad.
Palabras clave: semen; espermatozoide; Chlamydia trachomatis; Neisseria gonorrhoeae; Ureaplasma urealyticum; Mycoplasma spp.
ABSTRACT
Introduction: Vasectomy is a definitive method of male contraception, which prevents the passage of sperm through the vas deferens. However, seminal plasma has the ability to transport different microorganisms.
Objective: To determine the presence of DNA of C. trachomatis, N. gonorrhoeae, U. urealyticum, M. genitalium, M. hominis and the isolation by culture of aerobic bacteria in vasectomized semen samples.
Materials and methods: Semen samples from 10 vasectomized volunteers and 7 non-vasectomized volunteers, and apparently healthy, were collected and evaluated according to the World Health Organization guidelines. Quantitative culture on blood agar, chocolate and MacConkey, DNA extraction using the phenol-chloroform technique and DNA detection from the microorganisms using the polymerase chain reaction technique was performed in each semen sample.
Results: Some microorganism growth was obtained in the 10 vasectomized volunteers samples assessed. Some of them were Staphylococcus coagulase negative, Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, and Pseudomona putida. Only U. urealyticum DNA was detected in 70% of the seminal samples from vasectomized volunteers and in 57% in the volunteers.
Conclusion: Vasectomized men can be reservoirs of microorganisms (including microbiota) and transport those microorganisms to the female reproductive tract, which could cause important alterations such as infertility
INTRODUCCIÓN
La vasectomía es un procedimiento quirúrgico de anticoncepción masculina definitiva con un 99 % de efectividad que impide el paso de los espermatozoides a través de los conductos deferentes. Existen dos técnicas principales para realizar la cirugía y acceder a los conductos deferentes para su oclusión: la vasectomía tradicional en la cual se realizan dos incisiones en la bolsa escrotal, y la vasectomía sin bisturí. En esta última se realiza una sola punción en la parte apical de los testículos con el fin de localizar, ligar y cortar los conductos deferentes. Esta última es la técnica más popular por su rapidez, bajo costo y reducción de las complicaciones como hemorragias y hematomas.1 Dentro de estas dos técnicas se cuenta con diferentes métodos para lograr la oclusión de los conductos deferentes como ligadura y escisión, interposición fascial, cauterización térmica y electrocauterización.2
Durante las relaciones sexuales, los espermatozoides son transportados desde el tracto reproductivo (TR) masculino al TR femenino; sin embargo, durante este proceso también se transportan microorganismos, ya sea por adhesión del microorganismo al espermatozoide o por su capacidad de infectar el plasma seminal y los leucocitos.3
Se ha reportado que la microbiota del TR masculino puede ser alterada por factores como la humedad, la actividad endocrina, la anaerobiosis y la disponibilidad de nutrientes.4 La colonización microbiana comienza al nacer, con comunidades cada vez más ricas de microorganismos que se ensambla en todo el cuerpo durante la infancia.5-12
En los adultos, la microbiota puede ser alterada por la dieta,13-17 los ciclos hormonales,18 la actividad sexual18-21 y el ambiente, entre otros factores.22 En estudios sobre la microbiota del TR masculino se han reportado aislados de estafilococos coagulasa negativos, enterococos y corynebacterias en hombres fértiles aparentemente sanos;23-27 sin embargo, la alteración en la homeostasis de esta colonización puede desencadenar procesos infecciosos generalmente asintomáticos, lo que le da el carácter de infección crónica.28
Las infecciones del TR masculino se pueden clasificar en tres tipos:
Actualmente se conoce poco acerca de las comunidades bacterianas encontradas en el TR masculino o la importancia de la bacteriospermia en los hombres asintomáticos. Esto se debe a que los estudios previos de microbiota seminal se han centrado en gran medida en la detección e identificación de microorganismos de fácil cultivo, no así en aquellas especies bacterianas que requieren medios especiales para su aislamiento. Por este motivo, puede existir un censo incompleto de los microorganismos presentes en el semen.23 Entre los géneros bacterianos reportados en el fluido seminal se encuentran: Peptoniphilis spp, Anaerococcus spp, Finegoldia spp, Peptostreptococcus spp, Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Corynebacterium spp, Enterococcus spp, Lactobacillus spp, Gardnerella sp, Prevotella spp y Escherichia coli.23-27
Adicionalmente, Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrheae, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis y Mycoplasma genitalium son bacterias comúnmente involucradas en infecciones del TR masculino. Estos microorganismos son de difícil cultivo, por lo que es necesario emplear métodos moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para su diagnóstico. C. trachomatis es intracelular obligada. Su único reservorio es el ser humano y es catalogada como el principal agente causal de uretritis, orquitis, epididimitis, cervicitis mucopurulenta, enfermedad pélvica inflamatoria e infertilidad tubal.28,29 N. gonorrheae es la principal causa de uretritis en hombres, además de estar implicado en prostatitis y en epididimitis.30 Tanto N. gonorrheae como C. trachomatis, se consideran infecciones de transmisión sexual, un grupo de infecciones transmitidas de individuo a individuo por medio de las relaciones sexuales que pueden ser ocasionadas por múltiples microorganismos,31 entre los que se incluyen: virus,32,33 hongos o parásitos34 con amplias consecuencias sobre la salud como la enfermedad pélvica inflamatoria, muerte fetal, disfunción sexual e incluso la infertilidad.31,32
]]> Se ha observado que la presencia de U. urealyticum en el eyaculado afecta la concentración y la morfología espermática;35 M. genitalium produce uretritis y prostatitis en los hombres y en la mujer produce dolor pélvico y sangrado después de las relaciones sexuales. Finalmente, M. hominis se ve implicado en el desarrollo de vaginosis bacteriana, septicemia posparto y uretritis37 en hombres produce uretritis no gonocócica y prostatitis, es capaz de adherirse al espermatozoide y generar en la mujer endometriosis y trastornos en el embarazo como la muerte embrionaria.37Las infecciones de transmisión sexual y otros tipos de infecciones urogenitales aún presentan una alta prevalencia en la población mundial a pesar de ser fácilmente tratables y prevenibles.38 La vasectomía al ser un método anticonceptivo utilizado principalmente por hombres casados,30 deja de lado en gran parte los métodos de protección para enfermedades de transmisión sexual, como los preservativos, lo que favorece la transmisión de microorganismos.
El objetivo de este trabajo es determinar la presencia de ADN de C. trachomatis, N. gonorrheae, U. urealyticum, M. genitalium y M. hominis mediante PCR y el asilamiento por cultivo de bacterias aerobias en muestras seminales de hombres vasectomizados.
MÉTODOS
Se incluyeron 17 muestras seminales de voluntarios asintomáticos para infecciones urogenitales de la ciudad de Medellín, Antioquia, Colombia: 10 vasectomizados con una edad mediana de 39 años (29 a 55 años) y 7 sin vasectomía con una mediana de 25 años (23 a 45 años) como control. Las muestras de semen fueron obtenidas mediante masturbación en un recipiente estéril después de una abstinencia sexual de 2 a 5 días. Se evaluaron los parámetros seminales convencionales de acuerdo a los lineamientos establecidos en el manual para el análisis de semen humano de la Organización Mundial de la Salud (OMS).40 El manual de la OMS para el análisis de semen humano, sugiere que las muestras seminales diagnosticadas con azoospermia (sin espermatozoides) deben someterse a centrifugación a 3000 g/15 min y el sedimento debe ser analizado.40
Espermocultivo
El recuento e identificación de las bacterias aerobias se realizó mediante espermocultivo por siembra cuantitativa. Brevemente, 10 μL de semen de los voluntarios con vasectomía fueron sembrados en agar MacConkey (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), sangre y chocolate (Preparado a partir de Agar tripticasa soya, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania), y agar e incubados a 37 °C entre 24 y 48 h. Se realizó la identificación mediante pruebas bioquímicas y se determinó la resistencia o sensibilidad a los antibióticos para cada uno de los microorganismos en el Laboratorio de Microbiología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia.
]]> Extracción de ADN
La extracción de ADN se realizó de semen total mediante el protocolo de fenol-cloroformo estandarizado previamente en el Grupo Reproducción.41 Brevemente, a 200 μL de semen total se le adicionaron 0,5 mL de la solución de lisis (Tris 1M, EDTA 0,5M, NaCl 5M, SDS 10 % y tritón 0,1 %) y 5 μL de proteinasa K (20 mg/mL, Thermo-Scientific, MA, EE. UU.) y se incubó durante 12 h a 54 °C.
Posteriormente, se adicionó 1 mL de fenol-cloroformo-isomílico ( Amresco, Ohio, EE. UU.) y se centrifugó a 5000 g/10 min, al sobrenadante recuperado se le adicionó 1 mL de etanol absoluto (J.T Baker, EE. UU.) (-20 °C) y 50 μL de acetato de sodio 3M, se dejó precipitar el ADN a -20 °C durante 15 min. Finalmente, se lavó con 1mL de etanol (J.T Baker, EE. UU.) al 70 %, se diluyó el ADN en agua libre de DNAsa/RNAsa (Gibco, Life Techonologis, EE. UU.) y se cuantificó mediante espectofotometría (Nanodrop ND 1000 Spectophotometer, Thermo-Scientific, EE. UU.).
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La PCR se realizó mediante el protocolo estandarizado en el Grupo Reproducción con algunas modificaciones.41 Cada reacción tenía un volumen final de 25 μL que contenía 12,5 μL de Master Mix (Thermo-Scientific, EE. UU.), solución que contenía 0,025 U/μL de Taq DNA polimerasa, 2 mM de MgCl2 y 0,2 mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) diluidos en solución tampón de reacción. A cada reacción, se le adicionó 1 μM de cada cebador (tabla 1), 2 μL de ADN y 5,5 μL de agua. La PCR se realizó en un termociclador (T3000, Whatman, Biometria, Goettingen, Alemania) bajo las condiciones descritas en la tabla 1. Como control positivo, se empleó ADN extraído de las cepas de C. trachomatis serovar E (donada por el Dr. Rubén Motrich, Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e inmunología-CIBICI, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina) y Neisseria gonorrheae ATCC 19424 (donada por la IPS universitaria). Como control positivo de U. urealyticum. Se empleó ADN de muestras de semen positivas para este microorganismo (donadas por el Dr. Pedro Martínez, Centro Latinoamericano de Diagnóstico Genético Molecular -CELAGEN-, Bogotá, Colombia). Para M. genitalium y M. hominis se utilizaron productos de PCR positivos, mientras que como control negativo se utilizó una mezcla de reacción sin ADN.
Finalmente, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 2,5 % teñido con Sybr Safe (Invitrogen Life Technologies, EE. UU.) en solución tampón TAE (Tris, ácido acético y EDTA) durante 15 min a 100 V. Los productos de la reacción fueron comparados con el marcador de peso molecular de 100 pb (Hyperladder II 100 lines, Bioline, Life Sciencie Company, Londres, Reino Unido) y fueron visualizados en el fotodocumentador (Molecular Image Gel Doc TM XR Bio-Rad, CA, EE. UU.).
Análisis estadístico
Se realizó estadística descriptiva con el fin de comparar los grupos de individuos, además se realizó una prueba de Mann-Whitney y una prueba exacta de Fisher para determinar la diferencia entre los grupos según el caso mediante el programa estadístico Graph Pad Prism 6.0 ®.
]]>RESULTADOS
De los 10 eyaculados provenientes de hombres vasectomizados analizados en el presente estudio, se observó un voluntario con espermatozoides en el semen, una mediana para la edad de 3 años (39 años vs. 25 años), mayor en el grupo de vasectomizados (p= 0,02); la mediana de hijos fue de 2 en el grupo de vasectomizados y ninguno de los hombres en el grupo control tenía hijos. Adicionalmente, se observó un crecimiento bacteriano en todas las muestras. La mediana para el tiempo desde la vasectomía hasta la fecha del presente análisis seminal fue de 3 años.
Al voluntario que se le observaron espermatozoides tenía 8 años de vasectomizado, con un reporte previo de ausencia de espermatozoides en otro laboratorio (28 de diciembre de 2011) aunque en el presente eyaculado presentaba 1,4 mL de volumen, 3 × 106/mL de espermatozoides con una movilidad progresiva de 13 %, 50 % de viabilidad y 3 % de morfología normal. Adicionalmente, al cuantificar el estado de la estructura del ADN espermático se observó un índice de fragmentación del ADN (IFA) de 24,3 %.
En el cultivo de las 10 muestras seminales evaluadas se obtuvo crecimiento de algún microorganismo, la identificación se realizó a partir del agar sangre (tabla 2). Seis muestras presentaron crecimiento de Staphylococcus coagulasa negativo (concentración mediana de 1 200 unidades formadoras de colonia - ufc/mL); en las otras muestras creció Pseudomona putida (2 200 ufc/mL), Staphylococcus aureus (1200 ufc/mL) y Streptococcus del grupo viridans (2200 ufc/mL). En la tabla 2 se detallan los resultados de los antibiogramas realizados para los aislamientos bacterianos.
Las 10 muestras evaluadas de voluntarios vasectomizados y las 7 usadas como control fueron negativas para la detección de ADN deC. trachomatis, N. gonorrheae, M. hominis, y M. genitalium; en 64 % del total de las muestras seminales se detectó ADN de U. urealyticum, siete de las diez muestras de vasectomizados (70 %) y 4 de las 7 muestras en el grupo control (57 %) mediante PCR (p= 0,5).
DISCUSIÓN
Aunque está establecido que la vasectomía es un método anticonceptivo con un 99 % de efectividad,1 un 1 % de los individuos deben recurrir a una corrección mediante una nueva cirugía. En el presente trabajo se observó que 1 de los 10 voluntarios vasectomizados presentaba espermatozoides con valores por debajo del límite inferior de referencia propuesto en el manual de análisis seminal de la OMS.40
Es importante recalcar que hombres con valores menores que el percentil 5 (límite inferior de referencia) también son considerados como fértiles y han logrado embarazar a su pareja en menos de un año de relaciones sexuales sin protección.42 La falla más común de la vasectomía es la recanalización,2 que es el resultado de la proliferación de microtúbulos epiteliales a través de tejido granulomatoso entre los extremos cortados lo que produce una fístula que permite el paso de los espermatozoides;43 puede ser temprana (8 a 12 semanas posvasectomía), transitoria (semana 2 a 6) o tardía (se presenta luego de ser declarado estéril);2 este individuo presentaría una recanalización tardía debido a que tenía un control de vasectomía en diciembre de 2011, 2 años después de realizado el procedimiento quirúrgico en el cual es diagnosticado como azoospermico. La probabilidad de una recanalización varía según el método de oclusión, el mayor riesgo se ha reportado con ligadura y escisión;43,44 sin embargo, el riesgo más bajo se ha reportado con la cauterización.43 La de mayor eficacia fue la cauterización térmica (probabilidad de fracaso de 0,8 %)45 sobre la electrocauterización.44 En este caso no conocemos el método que se ha utilizado.
]]> Sin embargo, a pesar de la falla en el procedimiento quirúrgico y de no utilizar ningún método de anticoncepción adicional, el voluntario vasectomizado no ha embarazado a su pareja, incluso presentando un IFA considerado como normal. Este aspecto es importante, porque una alta fragmentación del ADN espermático puede afectar división celular de los embriones, los resultados se dividen en: < 15 %, excelente potencial de fertilidad; entre 15 y 24 %, alto potencial de fertilidad; 25-30 %, bajo potencial de fertilidad; y > 30 %, regular o mal potencial de fertilidad.46 El límite inferior de referencia para la movilidad progresiva es de 32 %, para la movilidad total (movilidad progresiva + movilidad no progresiva) es de 40 %; para la viabilidad es del 58 % y para la morfología es del 4 %.40La microbiota uretral y del TR está determinada por factores como la madurez y la actividad sexual, el número de compañeros(as) y el tipo de relación sexual (anal, oral o genital),47 en una de las 10 muestras seminales de voluntarios vasectomizados se observó el crecimiento de Streptococcus del grupo viridans, Cocos Gram positivos que hacen parte de la microbiota de la orofaringe y del tracto genital femenino.
Las infecciones clínicas por Streptococcus del grupo viridans ocurren, generalmente, tras una lesión en las zonas de su hábitat normal, como podría ser cirugía e instrumentalización del aparato genitourinario, no suele realizarle antibiograma. Sin embargo, se ha reportado la existencia de aislados con resistencia a la penicilina.48 Su crecimiento puede deberse a la colonización del tracto genitourinario por medio de relaciones de tipo genital u oral o por contaminación de la muestra desde las vías aéreas a la hora de ser tomada.
La mayoría de las muestras (66 %) presentaron un crecimiento de Staphylococcus coagulasa negativa, uno de los microorganismos más frecuentemente aislados. No obstante, es difícil de establecer su significado clínico en muchas situaciones pues pueden ser comensales inofensivos o patógenos invasores.49 Algunos autores proponen las especies pertenecientes al grupo de Staphylococcus coagulasa negativos (S. capitis, S. saprophyticus y S. epidermidis) como las principales responsables de las infecciones del TR masculino después de E. coli.50,51
S. epidermidis es la especie predominante aislada de pacientes con complicaciones de las vías urinarias, el S. saprophyticus es un conocido uropatógeno, aislado comúnmente en mujeres sexualmente activas, lo que podría significar fácil transmisión al TR masculino.49 Dos de estos aislados presentaron resistencia a los antibióticos eritromicina y cefoxitin, y solo una a ciprofloxacina. Esto pudiera complicar significativamente el tratamiento de una infección sintomática si se llegara a desarrollar, pues estos microorganismos podrían transferir los genes de resistencia; no solo a aquellos de su misma especie, sino también a otras especies por medio de plásmidos, secuencias de inserción, integrones, transposones y bacteriófagos, a través de recombinación.52
Staphylococcus aureus es un microorganismo oportunista que coloniza la piel, las fosas nasales, las axilas, la faringe y el tracto urogenital en aproximadamente 20 % de personas sanas.53 Es un patógeno oportunista y puede desencadenar ruptura del tejido por trauma o cirugía, no se descarta la posibilidad de que exista contaminación de la muestra con microbiota de la piel, debido a que hasta 71 % de las bacterias que colonizan el surco coronal están presentes en la uretra distal.23 No obstante, se encuentra entre los microorganismos más peligrosos para el ser humano, tanto por su virulencia y producción de toxinas, como por su capacidad para desarrollar resistencia a los antibióticos.54 En este caso se encuentra el microorganismo aislado. Su resistencia se obtiene por los mecanismos antes mencionados52 e indica que es un microorganismo adquirido y debería ser tratado pues aunque no siempre la bacteriosperma culmina en infección, la sola existencia de especies bacterianas o de los factores solubles producto de su metabolismo, pueden desencadenar una serie de efectos negativos en la salud sexual y reproductiva.53
Por otro lado, Pseudomona putida, es un bacilo Gram negativo, que también puede comportarse como un patógeno oportunista. Está reportada como un microorganismo patógeno e infeccioso. Aunque suele ser un contaminante de muestras clínicas, se ha visto involucrada en infecciones del tracto urinario.55,56 Pero, en el caso de todos estos cultivos, se puede descartar que se esté presentando una infección, debido a que para ser catalogada como tal se necesita una concentración mayor a 10 000 ufc/mL,57 criterio con el cual no cumple ninguna de las cepas aisladas.
U. urealyticum, M. genitalium y M. hominis son bacterias anaerobias facultativas, que se asocian con la colonización e infección genital en los seres humanos adultos, aunque también pueden aislarse con una alta prevalencia, siendo mayor la prevalencia U. urealyticum que la de M. hominis y M. genitalium en individuos asintomáticos, lo que sugiere que pueden comportarse como patógenos oportunistas.36 En este estudio, se logró detectar ADN de U. urealyticum en 64 % del total de las muestras, es el único microorganismo detectado, el cual cuenta con un porcentaje mayor en el grupo de hombres vasectomizados (70 %) con respecto al grupo control (57 %). Esta diferencia puede deberse a que este grupo tenga más relaciones sin protección para enfermedades de transmisión sexual y que no tengan interés en el tema de infertilidad, problema por el cual muchos hombres sin vasectomía consultan, son diagnosticados y tratados. En un estudio anterior del grupo Reproducción, se reportó una prevalencia de 7,1 % de U. Urealyticum.41
Aunque en este estudio no se logró detectar ADN de C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. hominis y M. genitalium, otros autores han detectado una prevalencia de 11,3 %, 13,3 %,57 10,8 % y 5 %,35 respectivamente de las muestras de semen de hombres asintomáticos.
]]> CONCLUSIÓN
La vasectomía es un método anticonceptivo masculino que, aunque cuenta con una alta efectividad, no está exento de fallas. Ellas se asocian, generalmente, a la disminución del uso de métodos anticonceptivos de barrera como el preservativo. El uso de métodos anticonceptivos en los vasectomizados tiene como segunda finalidad impedir la capacidad del plasma seminal de transportar microorganismos, tanto patógenos como microbiota, al tracto reproductivo femenino. Muchos de los microorganismos presentes en el semen son exigentes y de difícil cultivo, por lo que comúnmente no se detectan en exámenes de rutina, por esto es necesario recurrir a técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa.
Conflicto de intereses
Los autores no declaran tener conflicto de intereses.
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Recibido: 24 de octubre de 2017.
Aprobado: 17 de noviembre de 2017.
Walter Dario Cardona Maya. Grupo Reproducción, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
Correo electrónico: wdario.cardona@udea.edu.co
