0138-6557

S0138-65571997000100004

Cuba

00 06 1997

26 1 30 37

Expresión del antígeno HLA-DR1 en el infiltrado inflamatorio de carcinomas de piel y su relación con linfocitos TDr. Jorge Eduardo Abreu Ugarte,¹ Dra. María Antonia Cruz García,² Dra. Julia Cruz Mojarrieta³ y Dra. Teresita Rodríguez Obaya⁴

Especialista de I Grado en Histología. Profesor Asistente. Investigador Agregado.
Especialista de I Grado en Embriología. Instructora.
Especialista de I Grado en Anatomía Patológica.
Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Histología. Profesora Asistente. Investigadora Auxiliar.

RESUMEN

Se empleó un método inmunohistoenzimático con anticuerpos monoclonales IOR para estudiar in situ la expresión del antígeno HLA-DR1 en el infiltrado inflamatorio de carcinomas de piel y relacionarlo con la presencia de linfocitos T en éste. Se clasificaron los casos según el informe de Anatomía Patológica en 50 carcinomas de células basales y 30 epidermoides. No se encontró diferencia significativa en la expresión de HLA-DR1 al comparar ambos carcinomas. Se encontró relación entre la cantidad de células que expresan HLA-DR1 y de linfocitos T CD6+, CD3+ y CD2+ en ambos tumores y la subpoblación CD4+ en el epidermoide. La cantidad de CD8+ resultó escasa en todos los casos.

Descriptores DeCS: NEOPLASMAS CUTÁNEOS/inmunología; CARCINOMA BASOCELULAR/inmunología; CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS/inmunología; ANTÍGENO HLA-DR1; LINFOCITOS T; ANTICUERPOS MONOCLONALES; ANTÍGENOS CD.

INTRODUCCIÓN

En Cuba, el cáncer de la piel se encuentra entre los tumores malignos que más afectan a la población y son los carcinomas los de mayor incidencia.¹ Aunque éstos últimos tienen baja mortalidad, son capaces de producir severas deformaciones, sobre todo en la región facial (figura 1), donde son muy frecuentes.

En la actualidad se relacionan factores inmunológicos con la etiopatogenia de estas neoplasias.² Para muchos autores,^3-5 el infiltrado de células mononucleares que rodean el tumor es manifestación de la respuesta del huésped, por lo que el estudio de las células que lo componen ha ganado gran interés en los últimos años, tratando de establecer parámetros que permitan evaluar el comportamiento tumoral. La utilización de anticuerpos monoclonales ha permitido mayor precisión en la identificación de las poblaciones celulares que componen el infiltrado celular.

Por otra parte, es conocida la relación entre las células que participan en la respuesta inmunológica y los antígenos leucocitarios humanos (HLA), entre éstos, los DR.⁶ Los antígenos HLA-DR son sialoglicoproteínas que presentan un gran polimorfismo. Su importancia desde el punto de vista médico, radica en la asociación encontrada entre distintas enfermedades neoplásicas o no y determinados fenotipos HLA,^7-10 lo que constituye actualmente un novedoso campo de investigación.

Existen pocos estudios que asocien la expresión de HLA-DR con los carcinomas de la piel y menos aún, a la presencia de linfocitos en el infiltrado celular. Es por ello, que el presente trabajo se propone evaluar la expresión del antígeno HLA-DR1 y establecer una comparación de su comportamiento entre 2 variedades de carcinomas de piel, el carcinoma de células basales (CCB) y el epidermoide (CE), considerados por algunos autores como modelos opuestos de comportamiento tumoral,⁴ así como determinar su relación con la cantidad de linfocitos T de diferentes fenotipos para establecer su valor como parámetro diagnóstico y pronóstico.

MÉTODOS

Se estudiaron 80 pacientes atendidos en el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología con diagnóstico presuntivo de carcinoma de piel, de cualquier sexo, edad, raza y sin tratamiento anterior, ni otra enfermedad demostrable asociada. Se obtuvo muestras de los tumores en el momento de su exéresis quirúrgica. Aproximadamente la mitad de cada tumor se fijó en formol neutro al 10 % y se utilizó para el diagnóstico histopatológico, la otra mitad se conservó en nitrógeno líquido a -4 EC. A éste último fragmento se le realizaron cortes de 5 mm de grosor por congelación en criostato. Los cortes se colocaron en láminas histológicas y se fijaron en acetona durante 10 minutos para el estudio inmunohistoenzimático. ]]> Para identificar in situ la expresión del antígeno HLA-DR1 y los linfocitos T en el infiltrado inflamatorio de los tumores estudiados, se utilizaron los anticuerpos monoclonales desarrollados y producidos en el Centro de Inmunología Molecular y Anticuerpos Monoclonales (tabla 1). Para la detección de los anticuerpos primarios se empleó el sistema Streptoavidina-Biotina-Peroxidasa de la Amershan.¹¹ Las observaciones de las láminas histológicas se realizaron con aumento de 400X en un microscopio óptico Leitz Biomed. TABLA 1. Anticuerpos monoclonales empleados en el estudio

Anticuerpos	Células que identifica	Dilución
IOR T1	Linfocitos T (CD6+)	1 : 10
IOR T3	LInfocitos T (CD3+)	1 : 10
IOR T11	Linfocitos T (CD2+)	]]> 1 : 10
IOR T4	Linfocitos T (CD4+)	1 : 10
IOR T8	Linfocitos T (CD8+)	1 : 10
IOR DR1 de Antígenos, linfocitos B y linfocitos T activados.	Células presentadoras	1 : 10

Según especificaciones del productor (INOR, 1992)

Se evaluó cualitativamente la cantidad de células marcadas por los anticuerpos en los cortes histológicos. Se clasificó la muestra de acuerdo con los criterios de Synkowski et al.³ en 3 grupos, según el porcentaje de células marcadas:

]]> Porcentaje de células marcadas	Cantidad
De 0 a 25 %	Escasas
De 25 % a 75 %	Moderadas
De 75 % a 100 %	Numerosas

Se establecieron comparaciones entre ambos tumores y se relacionaron la expresión del antígeno HLA-DR1 y el número de linfocitos T presentes en cada tipo de tumor.

Como método estadístico se utilizó la prueba chi-cuadrado con un sistema de procesamiento Microstat, para analizar la homogeneidad de la muestra respecto a variables cualitativas.

RESULTADOS

La observación de las muestras tumorales coloreadas con hematoxilina y eosina a través del microscopio óptico con aumento de 400 X, permitió clasificar los 80 carcinomas estudiados en 50 CCB y 30 CE. Se logró localizar el infiltrado inflamatorio, formado fundamentalmente por células mononucleares y situado hacia la base de los tumores, con disposición focal, perivascular o en banda, entre los nidos de células tumorales. El grado de infiltración varió de intenso a moderado (figura 1).

FIGURA 1. Carcinoma de células basales en la región frontal de un paciente masculino de 61 años de edad ]]> Mediante la técnica inmunohistoenzimática empleada en los cortes por congelación se comprobó el marcaje de membrana específico de los anticuerpos utilizados (figura 2).

FIGURA 2. Aumento de 400X. Se observan células que expresan el antígeno HLA-DR1 en el infiltrado inflamatorio del carcinoma de células basales mostrado en la figura 1, identificadas con el anticuerpo monoclonal IOR-DR1

El 50 % de los casos en el CCB y el 46,6 % en el CE presentan numerosas células que expresan HLA-DR1; una cantidad moderada se encontraba en el 32 y 33,3 % de los tumores respectivamente. El 18 y 20 % mostraron escasas células que expresaban este antígeno. No se encontró diferencia significativa (p = 0,95) en la expresión del antígeno al comparar estas variedades de carcinomas (figura 3).

FIGURA 3. Expresión de HLA-DR1 en el infiltrado inflamatorio de los carcinomas estudiados.

Se observó que la expresión de HLA-DR1 en numerosas células se relacionó con una gran cantidad de linfocitos T CD6+, CD3+ y CD2+ en el 40, 26 y 46,9 % de los tumores. La expresión moderada de este antígeno se relacionó con moderada cantidad de CD6+, CD3+ y CD2+ en el 20, 8 y 26,5 % y a numerosas células T, en no más del 12 %. En un bajo porcentaje de casos se encontró una expresión numerosa del antígeno con escasos linfocitos de los fenotipos mencionados. Se encontró significación estadística (p < 0,05) en la relación de estos linfocitos y la expresión de HLA-DR1. Por otro lado, en las subpoblaciones CD4+ y CD8+ no se encontró significación estadística en su relación con la expresión de HLA-DR1 (p > 0,05), moderadas cantidades de CD4+ se relacionan con una expresión numerosa de HLA-DR1 en el 36 % de los casos y con moderada expresión del antígeno en el 18 %. Con relación a los CD8+, los mayores porcentajes de casos relacionaban escasas células con numerosa y moderada expresión de HLA-DR1, 46 y 32 % respectivamente. El porcentaje de casos con numerosas células CD4+ ó CD8+ no fue mayor del 2 % (tabla 2).

TABLA 2. Relación entre HLA-DR1 y la cantidad de linfocitos T en el infiltrado inflamatorio en carcinomas de células basales

		Expresión de HLA-DR1 en los tumores
Fenotipo de los	Cantidad de	Numerosa		Moderada		]]> Escasa		Valor de
Linfocitos T	Linfocitos T	No.	%	No.	%	No.	%	la "P"
	Numerosa	20	]]> 40	6	12	0	0
CD6+	Moderada	6	12	10	20	1	]]> 2	0,0034
	Escasa	2	4	2	4	3	6
	Numerosa	13	26	]]> 1	2	0	0
CD3+	Moderado	16	32	4	8	0	0	]]> 0,0041
	Escasa	4	8	8	16	4	8
	Numerosa	23	46,9	2	]]> 4,1	0	0
CD2+	Moderada	3	6,1	13	26,5	0	0	0,0000
	Escasa	]]> 1	2	4	8,2	3	6,1
	Numerosa	1	2	1	2	]]> 0	0
CD4+	Moderada	18	36	9	18	0	0	0,1684
	Escasa	10	]]> 20	7	14	4	8
	Numerosa	1	2	0	0	0	]]> 0
CD8+	Moderada	5	10	1	2	1	2	0,6609
	Escasa	23	46	]]> 16	32	3	6

En los linfocitos CD6+, CD3+, CD2+ y CD4+ se encontró significación estadística (p < 0,05), no así en los CD8+. En los primeros hubo relación entre la expresión numerosa y moderada del antígeno y las cantidades de linfocitos con los fenotipos mencionados, en los CD8+ el 56,7 % de casos mostraron escasas células relacionadas a una numerosa expresión de HLA-DR1 y el 16,7 % con moderada expresión (tabla 3).

TABLA 3. Relación entre HLA-DR1 y la cantidad de linfocitos T en el infiltrado inflamatorio en carcinomas epidermoides de piel

	Expresión de HLA-DR1 en los tumores
Cantidad de	Fenotipo de los	Numerosa		Moderada		Escasa		Valor de
Linfocitos T	Linfocitos T	]]> No.	%	No.	%	No.	%	la "P"
	Numerosa	11	36,7	0	]]> 0	0	0
CD6+	Moderada	7	23,3	4	13,3	0	0	0,0089
	Escasa	]]> 2	6,7	2	6,7	4	13,3
	Numerosa	5	16,7	0	0	]]> 0	0
	CD3+	Moderado	9	30	5	16,7	0	0
	Escasa	5	]]> 16,7	2	6,7	4	13,3
	Numerosa	13	43,3	0	0	0	]]> 0
CD2+	Moderada	5	16,7	4	13,3	0	0	0,0034
	Escasa	2	6,7	]]> 2	6,7	4	13,3
	Numerosa	1	3,3	0	0	0	0
CD4+	Moderada	]]> 14	46,7	1	3,3	0	0	0,0205
	Escasa	5	16,7	5	]]> 16,7	4	13,3
	Numerosa	1	3,3	0	0	0	0
CD8+	Moderada	2	]]> 6,7	1	3,3	0	0	0,8677
	Escasa	17	56,7	5	16,7	]]> 4	13,3

DISCUSIÓN

La intensidad y disposición del infiltrado inflamatorio en los tumores coincidió con lo descrito por otros autores.¹²

El estudio del antígeno HLA-DR1 con el anticuerpo monoclonal IOR DR1 se encontró presente en numerosas células del infiltrado inflamatorio de ambos carcinomas y esto correspondió con resultados obtenidos por otros investigadores,^5,13 empleando diferentes técnicas y anticuerpos. El marcaje del IOR DR1 no es específico para un tipo celular, ya que este antígeno se encuentra presente en linfocitos B, linfocitos T activados, macrófagos y células presentadoras de antígenos y endo-teliales.¹⁴

Resultados de estudios recientes¹⁴ establecen asociación positiva entre HLA-DR1 y los carcinomas de piel. En esta investigación la mayoría de los tumores estudiados presentaron numerosas células que expresan el antígeno y aunque las cantidades variaban de numerosa a escasa, no hubo diferencia significativa (p > 0,05) al comparar su comportamiento en las 2 variedades de carcinomas.

El antígeno HLA-DR1 representó solamente el 18,6 % de los antígenos HLA-DR en la población cubana, según recientes investigaciones;¹⁵ por tanto, quedaría aclarar si el resto de los fenotipos HLA-DR tienen relación con estos tumores o el propio HLA-DR1 la tiene con el tipo de diferenciación celular y por tanto, con el comportamiento biológico de los tumores. Por otro lado, al estudiar la relación entre la expresión de HLA-DR1 y las cantidades de linfocitos T presentes en el infiltrado inflamatorio de los tumores, se pudo establecer una asociación positiva entre los CD6+, CD3+ y CD2+, que son más numerosos en los casos con mayor expresión del antígeno. Existen bajos porcentajes de casos con numerosos linfocitos de los fenotipos mencionados y escasa expresión de HLA-DR1.

Se observó diferencias en el comportamiento de los CD4+ y CD8+, lo que pudo estar relacionado con los porcentajes de estas subpoblaciones en sangre. (65 y 35 % respectivamente).

Es destacable el comportamiento de los CD4+, que mostró diferencia en los carcinomas estudiados; en el CCB existió significación estadística y no ocurrió igual en el CE. El comportamiento diferente de los CD4+ puede tener importancia y relación con un comportamiento tumoral más agresivo del CE respecto al CCB y con la función que se le atribuye al antígeno HLA-DR en el reconocimiento intercelular, en particular con los linfocitos CD4+, los que no pueden iniciar la respuesta contra un antígeno extraño (canceroso o de otra naturaleza) hasta que éste no sea "presentado" por una célula que exprese un antígeno HLA-DR en su membrana celular.⁶

Por tanto, podemos concluir que el anticuerpo monoclonal IOR DR1 resultó ser un marcador útil para identificar en cortes histológicos las células que expresan el antígeno HLA-DR1 en su membrana celular.

No hay diferencia significativa en el comportamiento de las células que expresan el antígeno al comparar los 2 carcinomas estudiados y los mayores porcentajes de casos mostraron cantidad numerosa o moderada de células positivas al IOR DR1.

Se encontró relación entre la cantidad de linfocitos T CD6+, CD3+, CD2+ y CD4+ con la expresión de HLA-DR1 en el CE, en el CCB las tres primeras poblaciones de linfocitos también mostraron relación significativa, pero los CD4+ no. La población linfocitaria CD8+ resultó escasa en los dos tumores y su relación con el antígeno HLA-DR1 no fue significativa.

SUMMARY

An immune-histo-enzymatic method with IOR monoclonal antibodies was used to study in situ the expression of the HLA-DR1 antigen in the inflammatory infiltrate of skin carcinomas, and to relate it with the presence of T-lymphocyted in such infiltrate. Cases were classified according to the pathological anatomy report in 50 basal cell carcinomas, and 30 epidermoids. There was no significant difference in the HLA-DR1 expression when comparing both carcinomas. A relation was found between the amount of cells expressing HLA-DR1, and of CD6+, CD3+, and CD2+ T-lymphocytes in both tumors, and the CD4+ subpopulation in the epidermoid. The number of CD8+ was scarce in all cases. ]]> Subject headings: SKIN NEOPLASMS/immunology; T-LYMPHOCYTES; CARCINOMA, BASAL CELL/immunology; CARCINOMA, SQUAMOUS CELL/immunology; TUMOR MARKERS, BIOLOGICAL; HLA-DR1 ANTIGEN; ANTIBODIES, MONOCLONAL.

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Dr. Jorge Eduardo Abreu Ugarte. Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto" Ave. Monumental. Habana del Este. CP 11700. Ciudad de La Habana, Cuba. ]]> 1 1992 8 1 1 36-48 2 1988 87 1 1 177-83 3 1985 113 441-6 4 1986 66 29-34 5 1985 85 3 3 203-6 6 1993 9 1 1 413 7 1987 70 227-32 8 1987 43 1 1 156-83 9 1985 1 254-9 10 1993 9 1 1 65-7 11 1981 29 4 4 577-80 12 1989 5 1-2 1-2 31-42 13 1987 116 823-9 14 1988 176 176-81 15 1992 8 1 1 59