1. Licenciado en Bioquímica. Profesor Auxiliar.

RESUMEN

Descriptores DeCS: SAPONINAS/aislamiento & purificación; ALCOHOL ETILICO; AGENTES ANTICOLESTEREMIDOS/uso terapéutico; MEDICINA HERBARIA.

INTRODUCCIÓN

Desde el punto de vista químico, las saponinas al ser hidrolizadas rinden de 2 a 6 residuos de monosacáridos y una porción carbonada policíclica que es la aglicona del glicósido, a la cual se le denomina genéricamente sapogenina. Pueden tener un esqueleto tipo esteroidal (de base gonano) o de tipo triterpenoide (derivados del escualeno), las cuales dan lugar a las 2 grandes familias de estos metabolitos: las saponinas esteroidales y las saponinas triterpénicas.^1,2

La solubilidad en agua de estos compuestos está facilitada por su alto peso molecular y la presencia de los residuos de monosacáridos y de otros grupos polares en la agicona.^3,10

En ambas familias de saponinas el enlace glucosídico se establece a través del hidroxilo en posición 3 del anillo A de la aglicona. Las esteroidales, se localizan en monocotiledonias principalmente de las familias de las liliáceas, amarilidáceas y dioscoráceas y las triterpénicas en éstas y en algunas dicotiledóneas. Las sapogeninas esteroidales siempre se encuentran en la naturaleza formando parte de una saponina, a pesar de la presencia de saponasas, en muchas de las plantas que sintetizan estos compuestos.^7,11,18 Entre las saponinas esteroidales, cabe destacar aquéllas que tienen como aglicona a la hecogenina y la diosgenina, compuestos vegetales que sirven de base para la industria de hormonas esteroidales.

Las sapogeninas triterpénicas están ampliamente distribuidas en los reinos vegetal y animal y se presentan en 3 estructuras químicas diferentes (30-45 carbonos): aciclícas como el escualeno, considerado como el precursor natural de esta familia: tetracíclicas como el panaxadiol y pentacíclicas como la estallogenina. Estas sustancias pueden presentarse en sus fuentes naturales: en forma libre: formando ésteres, o como parte de un glicósido (saponina). Las sapogeninas pentacíclicas se subdividen a su vez en 3 grupos: tipo lupane: tipo ursane (derivado de la a amirina), ambos no están presentes en los forrajes¹ y los de tipo oleanane (derivados de la ß amirina) presentes en estos últimos.

Las 2 familias de saponinas referidas presentan un grupo de características generales que sirven de base para su identificación rápida: a) producción de espuma al ser agitadas sus soluciones acuosas, lo cual es la base de la reacción de selivoflo empleada en el tamizaje fitoquímico; b) producción de hemólisis de los glóbulos rojos por la mayoría de ellas, propiedad que se aprovecha en las técnicas en que se cuantifica la potencia de estas substancias; c) toxicidad en animales poiquilotérmicos, en especial los peces (sapotoxinas), a los cuales provocan parálisis de las agallas (se emplean en formas destructivas de pesca "pescar embarbascado"; d) producción de una reacción positiva en la prueba de Liebermann-Burchard. Por lo general, las esteroidales en esta prueba manifiestan colores que van desde el azul hasta el verde y las triterpénicas, rosado, rojo o violeta. Además, la mayoría de las saponinas son solubles en diferente grado en soluciones de etanol al 80 %, propiedad que se emplea en diversas técnicas para su extracción y purificación.

En la literatura científica se ofrece una abundante información acerca del papel de la fibra dietética "no digerible", en el secuestro de ácidos biliares y esteroles neutros en el tracto digestivo, mecanismo por el cual producen una disminución en la concentración del colesterol plasmático.^2,8,9,14 Se destacan en este sentido las fibras de la alfalfa, las de la paja del trigo y las de las pulpas de la caña y de la remolacha azucareras, entre otras, cuyo efecto en la acción referida se ha probado que está mediado por las saponinas presentes en ellas.^4,9 ]]> La planta objeto de extracción de saponinas en el presente trabajo; el Chenopodium quinoa Willd, se cultiva tradicionalmente en países sudameri-canos, a una altitud de 2 000-4 000 metros sobre el nivel del mar, en Chile, Argentina, Ecuador y Colombia, en pequeñas parcelas, y en Perú y Bolivia en grandes extensiones con un rendimiento de hasta 3 Ton métricas por hectárea.¹¹ También se cultiva en Asia, principalmente en Viet-Nam.

En los países mencionados el principal empleo de esta quenopodiácea es como fuente alimentaria para los humanos, muy reputada por su valor nutritivo, fundamentalmente el de su proteína, considerada superior a la de los cereales, las leguminosas de granos y otras de origen vegetal. Se destacan en ella, el elevado contenido en lisina, metionina y triptófano.¹ El mayor factor limitante en el consumo de la quinúa, es su elevado contenido de saponinas en el endospermo del grano que le transfiere un fuerte sabor amargo. Para obviar este inconveniente, las antiguas culturas de los Andes desarrollaron un método sencillo para la extracción de las saponinas, que consiste en lavar sucesivamente las semillas con agua fría hasta obtener un agua de lavado libre de espuma. Este proceder se emplea como paso inicial en algunas de las técnicas en que se extraen las saponinas a partir de los granos enteros.

En Cuba ha sido introducido el cultivo de Chenopodium quinoa Willd, denominado comúnmente quinúa a través del Instituto de Ciencia Animal, con vista a su empleo en la alimentación de aves y monogástricos y se ha recomendado por especialistas de esa institución el estudio de los aspectos de medicina humana relativo a las saponinas y el colesterol sérico, objeto del presente trabajo emprendido por el Laboratorio de Medicina Herbaria del ISMM.

MÉTODOS

Para la extracción de saponinas se siguió el proceder de M. E. Wall et al. (1958) mediante el cual el material es extraído con etanol acuoso al 80 % v\v. (300 mL de etanol/ 50 g de droga seca) y se hace el reflujo durante 1 hora. El extracto se concentró por sequedad, y se disolvió en etanol acuoso al 50 % v\v. Se le añadió igual volumen de benceno saturado con etanol al 50 % (25 mL/g del extracto bruto); se agitó vigorosamente y se centrifugó la mezcla.

Se repitió 2 veces el proceso de extracción y se eliminó en cada paso la fase bencénica con las grasas y pigmentos extraídos. La fase hidroalcohólica se evaporó hasta la sequedad y se obtuvo un material de color pardo oscuro, que es el crudo de saponinas.

La saponificación de saponinas se realizó según el proceder descrito por R. Segal et al. (1966) que consiste en 200 mg del crudo de saponinas que se disolvieron en 10 mL de etanol al 50 %. A esta disolución se añadió 1 mL de solución de KOH 1mol/L en metanol, y se hizo el reflujo durante 2 horas. La solución se refrescó y se acidificó ligeramente con solución de CLH 0,5 mol\litro y se evaporó el solvente con una corriente de aire a temperatura ambiente. El residuo se lavó 2 veces con pequeños volúmenes de agua y se cristalizó en metanol.

La potencia hemolítica se cuantificó según el proceder de R. Segal et al. para saponinas y sus derivados.

• Suspensión de glóbulos rojos: se utilizó sangre humana citratada, y se separó el plasma por centrifugación. El botón de eritrocitos se lavó 3 veces con buffer isotónico, hasta obtener un sobrenadante claro en la centrifugación. A partir de ese material se preparó una suspensión al 2 % de eritrocitos, disueltos en buffer isotónico.
• Buffer isotónico: Se disolvieron 3,95 g de PO4HNa2. 2H20: 0,76 g de PO4H2K y 7,20 de ClNa, para 1l de solución a PH 7,4.
• Muestras de saponinas: Se prepararon por disolución de los crudos en buffer isotónico, a una concentración inicial de 2 mg/mL.
]]> Para la prueba hemolítica se utilizaron volúmenes de 2 mL de suspensión de eritrocitos, se añadieron cantidades variables del agente hemolítico y se ajustó el volumen final de cada prueba a 4,0 mL, con buffer isotónico. Después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 4500 rpm durante 15 min. Dos mililitros del sobrenadante obtenido se disolvieron con igual volumen de buffer isotónico, se estimó la densidad óptica del hemolizado a una longitud de onda de 540 nm, y se leyó utilizando el buffer como valor de referencia cero. Se preparó una muestra patrón de hemólisis total, y se trató con agua destilada.

Para la estimación de la potencia hemolítica (valor H50 expresado en mg\mL, que es la concentración de saponinas que hemoliza el 50 % de los glóbulos), se calculó la ecuación de la recta de mejor ajuste, para 5 puntos de concentraciones diferentes y se dedujo de ello el valor H50.

RESULTADOS

A partir de la cascarilla procesada, se extrajeron y purificaron un grupo de crudos de saponinas, con un rendimiento comparable con otras preparaciones elaboradas en el laboratorio del ISMM a partir de granos enteros de quinúa. Los productos obtenidos, tienen la apariencia de gruesos cristales o grumos, de color pardo obscuro, sin olor característco, y en concentraciones similares a las utilizadas en la prueba hemolítica manifestó una fuerte positividad en la prueba de Selivoflo y en la reacción de Liebermann-Burchard, en la que el producto formado es de una coloración rojo obscuro, sugerente de saponinas triterpénicas. Esos crudos al ser reducidos a polvo, toman una tonalidad clara.

Del grueso del material obtenido, aproximadamente el 70 %, correspondió a las 2 primeras puliduras; en tanto que el rendimiento relativo en saponinas fue muy similar en las 4 primeras. El total de saponinas obtenidas, calculado en forma proporcional a la cuantía de granos procesados (2,38 %) fue muy similar al rendimiento obtenido cuando se parte directamente de estos para obtener los crudos (rendimiento de alrededor del 2 %). En tanto, cuando se realizó este cálculo sobre la base del total de cascarilla, el rendimiento fue de aproximadamente el 30 %; valor alto pero en concordancia con el material de partida para las extracciones; la cascarilla, que es el sitio de concentración de las saponinas en el grano. (tabla 1).

TABLA 1. Cantidad de cascarilla y rendimiento de saponinas según las puliduras

	Cascarilla (%)		Rendimiento en saponinas
Pulidura No.	Absoluto	Relativo	(g)	]]> % relativo
1	3,61	44,9	1,38	38,3
2	2,12	26,4	0,75	35,5
3	1,13	]]> 14,1	0,44	39,1
4	0,74	9,3	0,30	40,4
5	0,43	5,3	0,11	]]> 26,1
Total	8,03	100	2,98

Rendimiento bruto de 100 g de granos: 2,98 % (desengrasado 2,38 %)

Rendimiento bruto de la cascarilla de las 5 puliduras: 37,12 % (desengrasado 29,70 %).

La potencia hemolítica de los crudos fue evaluada con muestras en un recorrido de concentraciones de 5 a 50 mg\mL, y en pocos casos, con recorridos de 5-100 mg\mL (tabla 2).

TABLA 2. Potencia hemolítica de productos extraídos de la cascarilla de granos quinua. (Valores H50 en mg/mL)

Pulidura No.*		Saponinas	Saponinas saponificadas
1	Fina	]]> 33,8
	Gruesa	39,8	33,3
2	Fina	28,7	24,7
	Gruesa	37,5
3	Fina	28,4
	Gruesa	30,7	29,5
4	Fina	28,8	]]> 28,3
	Gruesa	42,6
5	Fina	33,7	22,7
	Gruesa	33,0	37,2

^* Fina: partículas < 0,420 mm. Gruesa: partículas > 0,420 <= 1,000 mm

La variabilidad de esas actividades oscilaron en un recorrido estrecho, con un valor de potencia máxima de 28,7 para la subfracción 2 fina, y mínimo de 42,6 para la 4 gruesa. Valorando esas cifras se pudo apreciar que la presencia de saponinas evaluadas desde el ángulo de su potencia fue bastante uniforme en las 5 puliduras, y por lo tanto, en trabajos futuros se pueden procesar como una muestra única a los efectos de la extracción. La potencia hemolítica de 6 de las subfracciones sometidas a proceso de saponificación con KOH metánolico se investigó con el objetivo de conocer la magnitud de la pérdida de la actividad hemolítica como consecuencia de esta transformación.

En el trabajo de R. Segal et al. se demuestra que la parte aglicona de las saponinas es la principal portadora de la actividad hemolítica y que por otro lado, el proceso de saponificación de éstas conlleva una pérdida notable de la potencia hemolítica de esas substancias. Esto se ejemplifica (tabla 3) con algunos datos de estos autores, en particular los referidos a las saponinas del Styrak officinalis.

TABLA 3. Potencia hemolítica de algunas saponinas, sapogeninas y derivados. (Valores H50 mg/mL) ]]>

(Datos de R. Segal et al.)		(Datos del Lab. de Herbaria, ISMM)
Medicina
Droga	H50	Droga	H50
Saponinas de styrax	1,47	Saponina blanca BDH	6,95
Saponinas de styrax saponificadas	> 1000	Saponina de quinúa LMH	34,2
Digitonina	3,7	Saponina de quinúa ICA-1	44,1
Sapogenina de styrax	0,4
Digitogenina	]]> 27	Saponinas de quinúa ICA-2	30,4
Diosgenina	52	Saponinas de quinúa-CAA	32,8
Diosgenina acetato	42	Saponinas de quinúa saponificada	36,3

Se observó que el grupo de saponinas de quinúa sometidos a saponificación sólo muestra un cambio muy ligero en su potencia hemolítica y en el sentido del incremento de ésta, en 5 de las 6 subfracciones saponificadas (tabla 2) lo que sugiere la presencia de los compuestos considerados, ya bien en forma de agliconas libres (sapogeninas triterpénicas), o en forma de algún derivado "no saponificable". A favor de esta hipótesis está el hecho de que en numerosas muestras de las saponinas obtenidas sometidas a hidrólisis ácida no ha sido posible constatar la presencia de azúcares reductores y que por otro lado, el total de crudos obtenidos presentaron una reacción negativa en la prueba de Molish.

El pequeño incremento de la potencia hemolítica de los materiales sometidos a saponificación podría explicarse por una mayor purificación de estos a través de ese proceso.

Conocer la posibilidad y magnitud del cambio en actividad hemolítica de los crudos saponificados obtenidos resulta de gran importancia, tomando en consideración el hecho ampliamente informado en la literatura científica acerca del papel que desempeñaron las saponinas presentes en la fibra dietética "no digerible" en el secuestro de ácidos biliares y esteroles neutros, uno de cuyos efectos principales es la disminución de la concentración del colesterol sérico,^{2,5,7,9,12,14} y que la mayor limitante en el empleo de estos compuestos (para saponinas que se absorban en el tracto digestivo) es precisamente la toxicidad asociada con su potencial hemolítico.

Según los datos anteriores, los crudos de "saponinas" de quinúa, no modifican favorablemente su capacidad hemolítica mediante el proceso de saponificación, aunque los datos obtenidos en el laboratorio del ISMM de su toxicidad aguda y los correspondientes a un modelo experimental de hipercolesterolemia, apoyan el empleo de las referidas substancias con los fines señalados.

Los datos correspondientes a los valores de potencia hemolítica de un grupo de crudos (tabla 3) algunos elaborados en el Instituto de Ciencia Animal y otros en el laboratorio del ISMM diferentes metodologías y utilizando como fuente de extracción los granos de quinúa o su cascarilla determinaron que el entorno de variabilidad es muy similar al de los datos correspondientes a crudos obtenidos de la cascarilla mediante una técnica diferente (tabla 2) todo lo cual expresa la confiabilidad de los diferentes métodos y la semejanza en contenido de las diversas fuentes empleadas. A fines de comparación de los crudos obtenidos en este trabajo se ofrece el valor de potencia a partir de un producto comercial (saponina blanca BDH) y algunos de los informados por Segal et al. Así se puede concluir expresando que se pudo corroborar que la cascarilla obtenida en el proceso industrial de la pulidura de los granos de quinúa, considerada un desecho, constituye una fuente para la obtención de saponinas. Los crudos obtenidos presentan características comparables con las de productos hipocolesteromizantes informados en la literatura científica. ]]> Las experiencias preclínicas realizadas en el Laboratorio de Medicina Herbaria del ISMM con los materiales referidos corroboraron el efecto hipocolesteromizante de los mismos y que además la dosis letal media es muy superior a las dosis farmacológicas necesarias para lograr el efecto referido.

Con los crudos saponínicos extraíbles de la quinúa se pueden substituir medicamentos actualmente deficitarios y además con un alto rendimiento, ya que se pueden obtener alrededor de 300 g de saponinas por Kg de cascarilla procesada.

SUMMARY

Crudes of saponins were obtained from the small thin shell of grains of Chenopodium Quinoa Willd (quinúa) by reflow with ethanol at 80 % v/v in order to use them as anticholesteraemia agents. The different batches of gross saponins obtained showed an average yield of 37.12 % on the basis of the total amount of small thin shell (8.03 %) and of 2.98 % on the basis of the whole number of grains. These products reacted strongly in the tests of Liebermann-Burchard and Selivoflo, and their hemolytic potency (H50 in mg/mL) was in the run from 42.6 to 28.4. 6 samples of crudes were subjected to saponification and no significant changes were observed in the hemolytic potency of the saponified products (H50 between 37.2 and 22.7). This fact, and the fact that the total of crudes had a negative reaction in the Fehling and Molish's tests, suggest that the products obtained are in the form of sapogenins or other non-saponifiable derivatives.

Subject headings: SAPONINS/isolation & purification; ALCOHOL ETHYL; ANTICHOLESTERAEMIA AGENTS/therapeutic use; MEDICINE HERBAL.

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My. Ricardo Hernández Royero. Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto". Avenida Monumental, Habana del Este, CP 11700. Ciudad de La Habana, Cuba. ]]> 1 1973 2 1981 47 45-52 3 1983 4 1983 396-414 5 1989 3 85-90 6 1952 24 1337-41 7 1987 65 9-15 8 1981 46 421-5 9 1974 104 458-62 10 1986 11 1985 35 148-62 12 1988 59 389-96 13 1966 15 1411-16 14 1986 55 643-9