TRABAJO ORIGINAL
AFLATOXINA M1 EN LECHE Y QUESO DE CABRA PRODUCIDOS EN APASEO EL GRANDE, GUANAJUATO, MÉXICO
AFLATOXIN M1 IN GOAT MILK AND CHEESE PRODUCED IN APASEO EL GRANDE,GUANAJUATO, MEXICO ]]>
Georgina Urbán*, J. Pérez*, F. Martínez*, R. Gutiérrez*, S. Vega*1, Marta Coronado*, A. Escobar**
*Departamento de Producción Agrícola y Animal. Universidad Autónoma Metropolitana. Unidad Xochimilco, México, D.F. 1Correo electrónico: svega@correo.xoc.uam.mx; **Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba
El presente estudio se realizó con el objeto de conocer el nivel de aflatoxina M1 (AFM1) en leche y queso de cabra. Las muestras de leche (n=60) fueron tomadas durante el periodo de julio del 2008 a junio del 2009 provenientes de 5 unidades de producción caprina. Las muestras de queso (n=20) se obtuvieron en julio de 2009. Las muestras fueron analizadas mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) bajo los métodos propuestos por la AOAC. Los resultados señalan que el 30% de las muestras de leche presentaron algún nivel de AFM1, el 18% de las muestras estuvieron por arriba del nivel máximo permitido (0.05 µg Kg-1) por la Comunidad Europea, con un nivel máximo de 1.61 µg Kg-1. Las muestras de queso presentaron un 15% de incidencia de AFM1, con un nivel máximo de 0.23 µg Kg-1.
Palabras clave: aflatoxina M1; leche; queso; cabra; México
ABSTRACT
The present study was conducted to assess the level of aflatoxin M1 (AFM1) in goat milk and cheese. Milk samples (n=60) were taken during the period July 2008 to June 2009 from 5 goats production units. Cheese samples (n=20) were taken in July 2009. Samples were analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) using the methods proposed by the AOAC. The results show 30% of milk samples with some level of AFM1, 18% were above the maximum permissible level (0.05 µg Kg-1) by the European Community, with a peak of 1.61 µg Kg-1. Cheese samples showed a 15% incidence of AFM1, with a maximum level of 0.23 µg Kg-1.
Key words: aflatoxin M1; milk cheese; goat, Mexico
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INTRODUCCIÓN
La aflatoxina M1 (AFM1) es un metabolito hidrolizado de la aflatoxina B1 (AFB1) que se excreta en la leche de animales lactando en una relación entre el 0.18-3% de la concentración inicial de AFB1 presente en el alimento consumido, variando de animal a animal, de día a día o de ordeño a ordeño (1, 2, 3). La Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC) en su clasificación en 2002 colocó a la AFM1 en el grupo 1 como un probable carcinógeno (4), considerando que presenta sólo el 10% de potencial carcinogénico y genotóxico de su precursor la AFB1.
La excreción de la AFM1 en leche de cabra alimentadas con una dosis única (0.8 mg/cabeza) fue detectada 1 h después de la ingestión, alcanzando su máxima concentración entre 3 a 6 horas después de la administración del alimento contaminado (5). La aflatoxina M1 al igual que otras aflatoxinas son compuestos muy estables y durante los procesos tecnológicos de la leche no presentan reducción significativa de su concentración, incluso, en quesos se ha vis-to un incremento significativo en la concentración de la AFM1 (6).
]]> El paso de la AFM1 de la leche al queso es complejo debido a la gran diversidad de procesos de elaboración y conservación, pero existe la tendencia a dividirse en una proporción 40:60 entre el cuajo y el suero en leche (7).
En México se han realizado algunos estudios para conocer la incidencia de la AFM1 en leche fluida de vaca (8,9,10,11), en leche en polvo (9) no existiendo información en productos lácteos como queso y yogurt. En caso similar de ausencia de información se encuentra la leche y el queso de cabra, por lo que el objetivo de este estudio fue conocer el nivel de aflatoxina M1 en leche y queso de cabra que se producen en Apaseo El Grande, Guanajuato, México.
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestreo
]]> Se colectaron muestras de 1 litro de leche de cabra, procedentes de cinco unidades de producción caprina (Mat, Pio, Col, Pas y Top) ubicadas en la región de Apaseo El Grande, Guanajuato, México, durante el periodo comprendido de julio de 2008 a junio de 2009, con una frecuencia mensual resultando 12 muestras por unidad productiva, haciendo un total de 60 muestras, para determinar el contenido de aflatoxina M1. La leche se transportó refrigerada al laboratorio en frascos de plástico y se almacenó a 4°C hasta su análisis. Todas las muestras fueron tomadas de los tanques de colecta bajo las pautas establecidas en la guía para el muestreo de leche y productos lácteos (12).
El muestreo de quesos se realizó siguiendo un diseño de muestreo de aceptación para la inspección por atributos (13), considerando un tamaño de lote de 3000 unidades, con un plan de muestreo simple y nivel de inspección especial S 4 (pruebas destructivas), con lo que se estimó el tamaño de la muestra (n=20). El nivel de calidad aceptable se estableció en 0.1% determinándose un Ac=0, Re=1. Las muestras de 250 g de queso se tomaron de una de las unidades de producción caprina.
Extracción y purificación de la AFM1
Leche. Se realizó de acuerdo a lo establecido en el método oficial propuesto por la AOAC(14). Las muestras de leche fueron descremadas mediante centrifugado refrigerado a 3000 rpm por 5 minutos. La Aflatoxina M1 se extrajo de la leche mediante una columna de fase sólida C18 acondicionada con metanol y agua, lavada con éter dietílico sobre otra columna de sílica gel y eluida con diclorometano metanol (95:5 v/v).
Queso. La extracción se realizó según lo establecido por la AOAC (15). La AFM1 fue extraída del que-so mediante cloroformo por agitación mecánica. Previamente filtrada se purificó en una columna empacada con sílica gel activada al 1% y sulfato de sodio anhidro, mediante un lavado con tolueno-acido acético (9:1) seguido de un lavado con hexano y otro de hexano-éter-acetonitrilo (50:30:20), la muestra se eluyó con cloroformo-acetona (8:2).
El eluato clorofórmico-acetona se rotoevaporó casi a sequedad bajo presión reducida a una temperatura de 30ºC, el residuo se termina de secar bajo una corriente de nitrógeno (99.999%).
]]>Derivatización. La aflatoxina M1 se derivatizó con ácido trifluoroacético. Método AOAC 986-16 (14) Al residuo seco se le adicionaron 100 µL de hexano, posteriormente se agregaron 50 µL de ácido trifluoroacético (TFA) y se colocaron en baño de agua a 40ºC durante 30 minutos. Una vez transcurrido este lapso de tiempo se evaporó bajo nitrógeno (99.999%). El residuo se resuspendió en 500 µL de la fase móvil antes de someterlo a la cromatografía de líquidos.
Análisis cromatográfico. Se utilizó un detector de fluorescencia (LaCrhom-7480) con longitud de onda de excitación y emisión de 365 y 425 nm respectivamente; acoplado a un cromatógrafo de líqui-dos de alta resolución Merck-Hitachi, empleando una columna fase reversa C 18 (Lichrocart 100).
La fase móvil empleada fue metanolacetonitrilo-agua (20:20:60) a flujo continuo de 1 mL/min. El volumen de inyección de la muestra y el patrón fue de 50 µL.
Los cromatogramas fueron registrados usando una interfase Perkin Elmer NCI 900 y procesados con el software Totalchrom versión 6.2.1.
Identificación y cuantificación. La preparación de la solución patrón de AFM1 (Sigma-Aldrich) se realizó bajo los preceptos recomendados por la AOAC en el método oficial 971.22 (16).
La concentración de la aflatoxina M1 en la solución de trabajo se corrigió empleándose un espectrofotómetro Beckman Coulter Dv 650 ajustado a una densidad óptica a 350 nm, empleando como blanco la mezcla de benceno – acetonitrilo. La evaluación de desempeño del método se realizó a través del recobrado, limite de detección y linealidad según Pérez y colaboradores durante la determinación de AFM1 en leche (8).
]]> Análisis estadístico. Estadística descriptiva. Estadísticos de resumen univariados (media aritmética, desviación estándar, mínimo y máximo) para las variables utilizadas (aflatoxina M1).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las condiciones cromatográficas permitieron obtener un pico definido para la aflatoxina M1, tanto para el patrón como para las muestras, lo que permitió evaluar las características de desempeño del método. El tiempo de retención para la Aflatoxina M1 fue de 3.13 ± 0.10 minutos (Figura 1).La curva de calibración (Y=103281x – 5948.7) mostró una linealidad significativa (p<0.05) y un coeficiente de determinación de 0.9982. Los límites de detección y cuantificación fueron 26.5 y 30.1 ng µL,1 respectivamente. El recobrado de la AFM1 en leche fue de 91% para un nivel de 40 µg Kg-1, con una precisión de 5%.
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La aflatoxina M1 se encontró presente en 18 (30%) de las 60 muestras de leche de cabra examinadas. Los niveles de contaminación variaron en los diferentes meses, no detectándose en los meses de julio, agosto, noviembre y diciembre del 2008, ni en junio de 2009. Los meses con mayor frecuencia (4 muestras de 5), fueron marzo y octubre con intervalos de 0.29 a 1.54 y 0.02 a 0.81 µg Kg-1. El valor de la mediana mayor fue encontrada en el mes de marzo (0.87 µg Kg-1). Estos resultados indican una ingesta de alimento con contenidos elevados de AFB1.
El 8.3% de las muestras analizadas presentaron niveles por arriba del LMR establecido de 0.5 µg Kg-1 por el Codex Alimentarius (3), FDA de los Estados Unidos (17) y la Norma Oficial Mexicana (13) (Tabla 1). Las muestras que presentaron contenidos superiores a los permitidos por la normatividad mexicana pertenecen a tres de las unidades productivas, siendo la denominada Pio, la que presentó un 58% de muestras con presencia de aflatoxina M1, de las cuales el 30% se encuentra en niveles superiores al límite máximo establecido por la comunidad Europea (0.05 µg Kg-1).
Los valores de las medianas, mínimos y máximos de los contenidos de aflatoxina M1 (µg kg-1) en muestras de leches de cabra, por unidad productiva se muestran en la Tabla 2. Las concentraciones de AFM1 variaron de 0.01 a 1.61 µg Kg-1 los valores de las medianas fluctuaron de 0.12 a 0.59 µg Kg-1, el valor máximo lo presentó, la unidad productiva denominada Pio (1.61 µg Kg-1), seguida de denominada Pas (1.54 µg Kg-1).
La incidencia de AFM1 en leche de cabra observada en el presente estudio (30%), está por debajo de los descritos en otros trabajos (18-21); sin embargo los niveles encontrados son muy superiores a los emcontrados por estos mismo autores, que reportan valores de AFM1 en leche inferiores a 0.05 Kg-1 en todas las muestras estudiadas en Italia (22-23), 0.011 y 0.161 µg L-1 en Brasil (20). Los estudios anteriormente mencionados hacen referencia que los niveles encontrados de AFM1 en leche de cabra no tienen significado como factor de riesgo para los humanos, en tanto que en este trabajo el 21.6% de las muestras presentaron niveles superiores a 0.05 µg Kg-1, con 8.3% de valores por arriba de 0.5 µg kg-1, lo que corrobora que los animales están expuesto a concentraciones elevadas de alfatoxina B1 en el concentrado.
]]>Los resultados encontrados en las muestras de queso de cabra permiten observar que 3 de ellas pre-sentaron algún nivel de AFM1, con un valor máximo de 0.23 µg Kg-1 y un mínimo de 0.1 µg Kg-1 (Tabla 3), lo que representa un 15% de incidencia con valores no significativos en cuestiones de salud pública. La incidencia en esta investigación es similar a la informada para quesos de cabra en Italia (24-25); sin embargo los valores encontrados en quesos de cabra italianos oscilaron entre 19 a 200 ng/kg (25), es decir hasta 10 veces el valor máximo encontrado en el presente trabajo. En otros estudios realizados en quesos producidos en Turquía, se obtuvieron valores mayores a los de este estudio; el valor máximo fue 860 ng Kg-1, (26).
La Norma Mexicana sobre quesos frescos, madurados y procesados no tiene nivel máximo permitido para la AFM1 explícito; sin embargo establece en el inciso 6.1 que la leche con que se elaboran estos productos debe cumplir con las especificaciones sanitarias marcadas en la norma de leche pasteurizada (27). Sin embargo, al considerar el nivel de tolerancia de AFM1 en queso (0.25 µg Kg-1), establecido por algunos países como Australia, Honduras, Suiza y Turquía (28), los resultados de este trabajo indican que todas las muestras están por debajo de este límite.
Finalmente, de acuerdo al criterio de nivel de calidad aceptable propuesto en el diseño experimental, el lote de quesos de cabra cumple con la especificación para ser aceptado, al no implicar ningún riesgo para la salud.
]]> Los resultados de este estudio indican la necesidad de elevar los niveles de conocimiento sobre la inocuidad de los productos lácteos respecto a la contaminación con AFM1, implicando un mayor énfasis en la aplicación de las buenas prácticas en el almacenamiento de alimentos de animales en México.
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(Recibido 20-11-2009; Aceptado 22-1-2010)
