0.05). En ovejas el grupo control tuvo una viabilidad de 100% en todos los diferentes estadios de desarrollo embrionario. La viabilidad total en los embriones calentados fue de 63,1% y la mayor viabilidad la presentaron las mórulas 76,1% y los embriones de 8-16 blastómeros 68,1%, aunque la diferencia no fue significativa (p>0.05). La viabilidad obtenida después de 72 horas de cultivo de los embriones calentados fue de 1.5% de mórulas de cerda y 2.8% de blastocistos de oveja; en este último hubo cambio de estadio de dos mórulas a blastocisto. Se concluye que el procedimiento de vitrificación en pajilla abierta biselada usando etilén glicol y trehalosa como crioprotectores permitió la recuperación de embriones de cerda y oveja viables al momento de la desvitrificación, aunque el desarrollo posterior a este proceso disminuye su desarrollo.]]>
Viabilidad después de la vitrificación de embriones de cerda y oveja producidos in vitro
Viability after vitrification of sow and sheep embryos produced in vitro
F. Fernández ReyesI,II, J.E. Hernández PichardoI,II, J.G. Romero RamírezI,II, J.L. Rodríguez SuastéguiI
IUniversidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X). Calzada del Hueso 1100, Colonia Villaquietud, Delegación Coyoacán, CP. 04960, México, D.F. Correo electrónico: freyes@correo.xoc.uam.mx.
II Cuerpo Académico Manejo de la Reproducción Animal. ]]>
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la viabilidad después de la vitrificación de embriones de cerda y oveja producidos in vitro. Los Complejos Ovocito-Células del Cúmulo (COCs) fueron obtenidos por punción de folículos de 3 a 6 mm de diámetro a partir de ovarios colectados en rastro. La viabilidad fue evaluada en tres grupos de embriones: sin vitrificar (grupo control), después de la vitrificación (calentamiento) y a 72 horas de cultivo después del calentamiento. La vitrificación se realizó en dos pasos; se inicio con etilén glicol (EG) 4% (v/v) y suero fetal bovino (SFB) 20%, en TCM-199 a 37 ºC por 15 minutos, posteriormente fueron transferidos a solución de vitrificación EG 35%, trehalosa 0.4 M y SFB 20% en TCM-199, finalmente fueron colocados en pajillas abiertas biseladas (BES). Las pajillas fueron sumergidas y conservadas en nitrógeno líquido por una semana. En cerdas el grupo control presentó una viabilidad total de 74,3% y los embriones de 8-16 blastómeros y mórulas tuvieron el 100% de viabilidad. La viabilidad total en los embriones calentados fue de 49,3% y la mayor viabilidad la presentaron los embriones de 8-16 blastómeros 63,7% y las mórulas 61,7%, aunque la diferencia no fue significativa (p>0.05). En ovejas el grupo control tuvo una viabilidad de 100% en todos los diferentes estadios de desarrollo embrionario. La viabilidad total en los embriones calentados fue de 63,1% y la mayor viabilidad la presentaron las mórulas 76,1% y los embriones de 8-16 blastómeros 68,1%, aunque la diferencia no fue significativa (p>0.05). La viabilidad obtenida después de 72 horas de cultivo de los embriones calentados fue de 1.5% de mórulas de cerda y 2.8% de blastocistos de oveja; en este último hubo cambio de estadio de dos mórulas a blastocisto. Se concluye que el procedimiento de vitrificación en pajilla abierta biselada usando etilén glicol y trehalosa como crioprotectores permitió la recuperación de embriones de cerda y oveja viables al momento de la desvitrificación, aunque el desarrollo posterior a este proceso disminuye su desarrollo.
Palabras clave: cerda, oveja, vitrificación, viabilidad, embrión, maduración in vitro, fertilización in vitro.
ABSTRACT
This study was aimed to assess the viability after vitrification of sow and sheep embryos produced in vitro. Complexes Oocyte-cumulus cells (COCs) were obtained from ovaries collected from sows and sheeps in the slaughterhouse. The viability was evaluated in three groups of embryos: unvitrified (control group), after vitrification (warming) and at 72 hours of culture after warming. The vitrification used two steps with ethylene glycol (EG) 4% (v/v), fetal bovine serum (FBS) 20%, in TCM-199 at 37 °C for 15 minutes, then the embryos were transferred to a vitrification solution of 35% EG, 0.4 M trehalose, and 20% FBS in TCM-199 for 20 seconds and finally placed in beveled edge open straws (BES). The straws were immersed and kept in liquid nitrogen for a week. The total viability of the vitrified/warmed embryos from sows was 49.3%, and the highest viabilities were shown by the 8-16 blastomere embryos (63.7%) and the morulae (61,7%), though the differences were not statistically significant. The total viability in the control group was of 74.3%, and the 8-16 blastomere embryos and morulae had 100% of viability. The total viability of the vitrified/warmed embryos from sheeps was 63.1%, and the highest viabilities were shown by the morulae (76.1%) and the 8-16 blastomere embryos (68.1%), though the differences were not statistically significant. The total viability in the control group was 100% in all the different stages of the embryonic development. The viability obtained after culturing the vitrified/warmed embryos for 72 hours was 1.5% of sow morulae and 2.8% of sheep blastocysts; in the latter, two morulae changed to blastocysts. It is concluded that the vitrification procedure in beveled edge open straws using ethylene glycol and trehalose as cryoprotectants allowed recovering of sow and sheep embryos viable at the devitrifying moment, but their further development is reduced.
Key words: sow, sheep, vitrification, viability, embryo, in vitro maturation, in vitro fertilization.
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INTRODUCCIÓNPara la obtención de embriones in vitro se requiere de la maduración de ovocitos y de su fertilización in vitro. En años recientes se han realizado estudios para conocer cuáles son las condiciones necesarias durante el proceso de cultivo para maximizar su producción. Se observó que la maduración citoplásmica y nuclear, así como la fertilización, la formación de pronúcleos y la división, son influenciados por factores que contienen los fluidos foliculares y oviductales, componentes del suero, hormonas esteroides y gonadotropinas (1). De manera natural las células foliculares proveen de nutrientes al ovocito y de energía a las células de la granulosa (2). Por lo que es importante considerar el tamaño del folículo y las capas de células de la granulosa que conforman al complejo ovocito células del cúmulo (COCs).
La importancia de los cerdos como modelo en las investigaciones biomédicas se ha incrementado sobre todo por considerarse de bajo costo; sin embargo los embriones porcinos son excesivamente sensibles a bajas temperaturas y el éxito en la criopreservación generalmente se limita al uso de la vitrificación en un sistema abierto, que permite el contacto directo del embrión con el nitrógeno líquido (3). La disminución en su desarrollo de los embriones vitrificados puede deberse al tiempo requerido para la remoción del nitrógeno líquido o al medio de calentamiento (4). Por otra parte la vitrificación de ovocitos reduce la capacidad de fertilización in vitro y baja capacidad de desarrollo, como consecuencia de la alteración en la permeabilidad de la membrana plasmática (5). Con la vitrificación se han observado en ovocitos alteraciones en el citoesqueleto, en las funciones de la mitocondria y la disminución en la habilidad de las defensas antioxidantes (6).
La viabilidad de los ovocitos o embriones vitrificados en muchos casos no es valorada antes de continuar su desarrollo después de la vitrificación, debido a que se asume que son viables porque alcanzan su maduración o su fertilización, así como su desarrollo embrionario. Así en embriones de ovino se considera que son viables al valorar cambios en su desarrollo o bien al lograr la gestación y el nacimiento de crías (7) o por la re-expansión y formación de blastocistos (8). Sin embargo, una gran cantidad de ovocitos y embriones no sobreviven al proceso de vitrificación disminuyendo su número conforme avanza su desarrollo in vitro o in vivo. Lo cual ha llevado a buscar otras alternativas de procedimientos de vitrificación, como ejemplo se tiene la substitución del suero fetal por polímeros (9). También se ha observado que las bajas concentraciones de calcio en el medio de vitrificación están asociadas a un mayor desarrollo de blastocistos (10).
Considerando que una alternativa para preservar el material genético de animales sobresalientes puede ser la criopreservación de embriones, el objetivo del presente trabajo fue realizar la vitrificación y evaluar la viabilidad después del calentamiento de embriones de cerda y oveja producidos in vitro usando etilén glicol y trehalosa en pajilla abierta biselada (adaptación realizada a la pajilla de 0,25 mL).
MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta y maduración in vitro de ovocitos.
Los ovarios se colectaron en el rastro, a partir de cerdas y ovejas púberes recién sacrificadas y se transportaron al laboratorio a una temperatura de 26 °C en un tiempo menor de 2 horas. Se puncionaron y aspiraron los folículos ováricos con un diámetro de 3 a 6 mm, utilizando una jeringa desechable de 10 mLy una aguja hipodérmica de 18 x 38 mm para la obtención del líquido folicular, el cual se dejó sedimentar en cerda por tres periodos de 15 minutos. A partir del sedimento se obtuvo el paquete celular, que se lavó dos veces con medio modificado de Tyrode suplementado con lactato de sodio, Hepes y PVA (TL-Hepes-PVA), con un pH de 7.3 a 7.4. En el caso de ovejas se puncionaron y aspiraron folículos del mismo tamaño que en cerdas, pero a la solución de lavado se adicionó 5 UI de Heparina/mL y solamente se realizó un periodo de sedimentación de 15 minutos (11). En ambas especies bajo el microscopio estereoscópico, se seleccionaron los Complejos Ovocito-Células del Cúmulo (COCs), eligiéndose aquellos que presentaron citoplasma uniforme y que estaban rodeados por una masa completa de cuatro capas de células del cúmulo. Los ovocitos seleccionados, fueron cultivados para su maduración en medio para cultivo de tejidos TCM-199 con sales de Earle y bicarbonato, suplementado con PVA al 0.1%, D-glucosa 3.05 mM, piruvato de sodio 0.91 mM, cisteína 0.57 mM y factor de crecimiento epidérmico (EGF) 10 ng/mL (12,13). Se depositaron de 30 a 40 COCs por pozo, en una caja de 4 pozos conteniendo 500 ìL de medio de maduración en cada uno. Posteriormente, cada pozo fue cubierto con una capa de aceite mineral y finalmente se le agregaron 1.5 U.I. de Merional (IBSA, Suiza), (equivalente a 1.5 U.I. de LH y 1.5 U.I. de FSH) (14). Las cajas se incubaron a 39 °C en una atmósfera de CO2 al 5% y humedad a saturación, durante 44 horas los ovocitos de cerda (12) y por 24 horas los ovocitos de oveja (15).
Fertilización in vitro ]]>
A los ovocitos de cerda una vez transcurrido el tiempo de maduración a cada pozo, se agregaron 300 ìL de hialuronidasa al 0.1% para eliminar las células del cúmulo. Los ovocitos fueron desnudados mecánicamente, utilizando una pipeta Pasteur y posteriormente fueron transferidos a gotas de 50 ìL de medio de fertilización Tris-Buffered-Medium (TBM), suplementado con cafeína 2.5 mM y BSA fracción V, al 0.4%. Las gotas, en cajas de 4 pozos, son cubiertas con aceite mineral, e incubadas a 39 °C, con 5% de CO2 y humedad a saturación (12). Posteriormente los ovocitos fueron fertilizados usando semen congelado. El proceso de descongelación del semen se realizó a 37 °C por 45 segundos en una solución amortiguadora de fosfatos de Dulbbecco (DPBS) suplementada con BSA fracción V al 0.1%, a un pH de 7.2-7.3 y se centrifugó a 1900 x g 5 min, el paquete celular es diluido en TBM. Después de hacer las diluciones apropiadas, 50 ìL de esta suspensión de espermatozoides se agregaron a una gota de 50 ìL del medio de fertilización, que contenía a los ovocitos, para obtener así la concentración final deseada 5 X 105 de células espermáticas/mL y se llevó a cabo la coincubación por un periodo de 5 horas (12). En el caso de los ovocitos de oveja, no se desnudaron y se fertilizaron con semen congelado bajo el mismo procedimiento utilizado en ovocitos de cerda, agregando 250 ìL del medio de fertilización a una gota del mismo volumen, para obtener una concentración de espermatozoides 1 X 106 y fueron coincubados por un periodo de 21 horas (11).Desarrollo embrionario in vitro
Transcurrido el tiempo de coincubación los cigotos de cerda se lavaron y fueron transferidos a gotas de 500 ìL de medio de desarrollo embrionario North Carolina State University (NCSU-23) (16). En los ovinos una vez transcurrido el tiempo de coincubación los cigotos fueron lavados y transferidos a gotas de 500 ìL de medio de desarrollo embrionario Fluido Oviductual Sintético (SOF) (IN VITRO, México), (11,17). Los dos grupos fueron incubados a 39 °C en una atmósfera de CO2 al 5% y humedad a saturación, durante 144 horas. Transcurrido este tiempo se evaluó el desarrollo embrionario.
La evaluación del desarrollo embrionario consistió en clasificar a los embriones de acuerdo al número de blastómeros o etapa de desarrollo (mórula o blastocisto), posteriormente se determinó la calidad morfológica de los embriones en base a los criterios propuestos por Stringfellow y Seidel, (18):
Calidad 1. Excelente. Embrión compacto (la masa celular debe ser mayor al 85%), esférico, de color claro, desarrollo de acuerdo a su edad, pocas vesículas, sin desechos celulares, ni blastómeros extruidos.
Calidad 2. Bueno. Embrión compacto o con una leve descompactación (por lo menos el 50% de las células deben estar intactas), poco irregular, color uniforme, desarrollo de acuerdo a su edad, presencia de pocas vesículas y blastómeros extruidos, pocos desechos celulares.
Calidad 3. Regular. Descompactación, muy marcada (por lo menos el 25% de las células deben estar intactas), desechos celulares, color obscuro o zonas claras y oscuras, vesículas, blastómeros extruidos y masa pequeña.
Calidad 4. Malo o no Transferible. Embrión con una degeneración muy marcada, masa pequeña (menor al 25% de lo normal), color obscuro, descompactación, vesículas e irregularidades en los blastómeros.
La viabilidad fue evaluada en tres grupos de embriones; 1) sin vitrificar (grupo control), 2) después de la vitrificación al momento del calentamiento y 3) a 72 horas de cultivo después del calentamiento. Para evaluar la viabilidad los embriones fueron puestos en solución de MTT (azul de tiazolil) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA) por un lapso de 2 horas.
Vitrificación de embriones ]]>
Una vez que se obtuvieron los embriones in vitro de porcino y ovino, se procedió a la vitrificación de los embriones clasificados con categoría 1 y 2 en ambas especies, usando un medio de equilibrio que contiene etilén glicol (EG) 4% (v/v) y suero fetal bovino (SFB) 20%, en TCM-199 a 37ºC por 15 minutos, posteriormente se transfirieron a solución de vitrificación que consistía en EG 35%, trehalosa 0.4 M y SFB 20% en TCM-199 por 20 segundos a 37ºC y se colocaron en pajillas abiertas biseladas (BES), (19). Las pajillas se sumergieron en nitrógeno líquido y se conservaron por una semana. Para el calentamiento (desvitrificación), las muestras se colocaron por 3 minutos en tres soluciones contentivas de 800 µL de medio TCM-199 + SFB 10% y diferentes concentraciones de trehalosa 0.3 M, 0.2 M y 0.1 M, de acuerdo al procedimiento adaptado de Al-Aghbari & Menino (15). Una vez desvitrificados los embriones fueron divididos en dos grupos; en uno se evaluó la viabilidad con azul de tiazolil (MTT) al momento del calentamiento (desvitrificación) y en el otro se evaluó la viabilidad con la misma tinción después de su incubación. Estos embriones fueron lavados y colocados en medio de cultivo específico para cada especie NCSU-23 (16) ó SOF (11), respectivamente e incubados por 72 horas (7).Análisis estadístico
Los resultados obtenidos fueron evaluados estadísticamente mediante la prueba de independencia de Chi-cuadrada por cada una de las etapas de desarrollo, por grupos y especie (20).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de viabilidad obtenidos en mórulas de cerda después del calentamiento (Tabla 1), son similares al 67% a 74% de supervivencia que reportan Sanchez-Osorio et al. (21), al vitrificar mórulas obtenidas in vivo. Se ha observado que la delipidación de mórulas aumenta su sobrevivencia después de la vitrificación a 82,5% Esaki et al. (22) y puede llegar al 95% Ushijima et al. (23), pero al no retirar los lípidos antes de la vitrificación estos últimos autores mencionan que la viabilidad disminuye a 57%. Por otra parte la viabilidad obtenida en los embriones de 8-16 blastómeros fue mayor al 50% citado por Nagashima et al. (24), para este mismo estadio de desarrollo embrionario. Los resultados indican que el procedimiento utilizado en el presente trabajo fue favorable para obtener viabilidad en embriones de cerda en diferentes estadios de desarrollo embrionario. Así mismo se observó que los embriones en etapas de mayor desarrollo sobreviven más al proceso de vitrificación. Posiblemente el recipiente utilizado también pudo contribuir en los resultados de viabilidad obtenidos ya que Arav et al. (25), indican que el volumen de la solución de vitrificación incrementa la proporción de enfriamiento y resulta en una vitrificación exitosa.
El porcentaje de viabilidad de los embriones de oveja obtenido en el presente estudio después del calentamiento fue mayor en los embriones con estadios más avanzados de desarrollo (Tabla 2), siendo similares a los resultados reportados por Shirazi et al. (8), ellos observaron una mayor supervivencia a la vitrificación de embriones de 16 blastómeros que de 8. La viabilidad total obtenida en los embriones queda dentro del rango del 50% a 93% de viabilidad de blastocistos reportado por Zhu et al. (26). Aunque la viabilidad de los embriones vitrificados en etapa de blastocisto puede disminuir cuando la recuperación de la re-expansión de los blastocistos calentados sucede en un periodo de 8 horas que cuando ocurre a las 16 horas (7). El procedimiento de vitrificación utilizado en embriones de oveja en el presente estudio fue favorable para obtener viabilidad en los diferentes estadios de desarrollo embrionario y el recipiente utilizado también pudo contribuir en los resultados de viabilidad obtenidos. Estos resultados indican que la vitrificación de embriones es factible y que puede superar al bajo porcentaje de división y desarrollo que sufren los ovocitos de ovino vitrificados para llegar a la etapa de blastocisto (27).
Los embriones de oveja tuvieron un mejor comportamiento en su desarrollo en el cultivo in vitro después del calentamiento (Tabla 3), aunque estadísticamente la diferencia no fue significativa (p>0.05). Se confirma lo citado por Gil et al. (28), quienes reportan que el porcentaje de desarrollo embrionario in vitro en porcino es bajo y de baja calidad. Aunque Nagashima et al. (29), mencionan que los embriones en mayor estadio de desarrollo presentan mayor viabilidad al ser criopreservados. En el presente estudio sólo las mórulas fueron las que presentaron viabilidad a 72 horas de cultivo después del calentamiento y en oveja hubo cambio de estadio de 2 mórulas a blastocisto. Estos resultados confirman que existen diferencias de ovocitos y embriones entre especies, lo cual dificulta la aplicación de la técnica de vitrificación como lo reportan Saragusty y Arav, (30). Por otra parte se tiene conocimiento de que embriones de ovino producidos in vivo y congelados sufren alteraciones estructurales debidas al procedimiento de congelación (31). La ausencia de desarrollo hasta blastocisto y la disminución en la supervivencia de los embriones obtenidos in vitro y vitrificados en el presente estudio, pudo ser consecuencia de los cambios de presión osmótica en el interior del embrión justo después del calentamiento, ya que ésta es muy alta por el contenido de crioprotectores y por consiguiente puede ocurrir una afluencia rápida de agua y causar un choque osmótico como lo mencionan Cuello et al. (32).
Se concluye que el procedimiento de vitrificación en pajilla abierta biselada usando etilén glicol y trehalosa como crioprotectores permitió la recuperación de embriones de porcino y ovino viables al momento del calentamiento (desvitrificación), siendo los estadios de 8-16 blastómeros y mórulas los de mayor viabilidad, aunque el desarrollo in vitro posterior a este proceso disminuye su desarrollo.
Los resultados obtenidos de viabilidad con la pajilla abierta biselada (BES) propuesta en el presente trabajo puede ser una opción como recipiente a usar por el bajo costo y los beneficios que puede representar. ]]>
AGRADECIMIENTOS
A los rastros Los Arcos y El Rojo, del estado de México, por proporcionar los ovarios.
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Recibido: 14-1-2012. ]]> Aceptado: 19-12-2012.
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