Tipificación multilocus de secuencias aplicada a la caracterización molecular de hemoparásitos en el ganado bovino

Multi-locus sequence typing applied to the molecular characterization of hemoparasites in cattle

Adrian Alberto Díaz-Sánchez, Siomara Martínez-Marrero, Belkis Corona-González*

Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria, Apartado 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

RESUMEN

Los marcadores moleculares son valiosas herramientas en la investigación de la diversidad genética, la estructura poblacional y evolutiva de importantes agentes infecciosos, y tienen un enorme impacto en el diseño e implementación de estrategias de control. Para la tipificación de microorganismos patógenos se han desarrollado varios métodos, los cuales difieren en el poder discriminativo, la reproducibilidad y la facilidad de interpretación. La tipificación multilocus de secuencias se propuso en 1998 como un método universal y definitivo para la caracterización de bacterias, utilizando el patógeno Neisseria meningitidis como objeto de estudio. Actualmente, se cuenta con un número cada vez mayor de protocolos de tipificación multilocus de secuencias desarrollados y empleados en investigaciones epidemiológicas a diferentes escalas, así como en estudios de biología y estructura de distintas poblaciones microbianas, análisis de patogenicidad y evolución bacteriana. En el presente trabajo se exponen, de forma general, los principales esquemas de tipificación basados en esta metodología para el estudio de hemoparásitos que afectan el ganado bovino.

Palabras clave: marcadores moleculares, tipificación multilocus de secuencias, PCR, hemoparásitos, bovino.

ABSTRACT

Molecular markers are valuable tools for researches on the genetic diversity, population and evolutionary structure of important infectious agents, and they have a great impact on the design and implementation of control strategies. For the typing of pathogenic microorganisms, several methods have been developed differing in the discriminative power, reproducibility and easy of interpretation. The multi-locus sequence typing was proposed in 1998 as a universal and definitive method for the characterization of bacteria, using the pathogen Neisseria meningitidis as the object of study. There is currently an increasing number of multi-locus sequence typing protocols developed and used in epidemiological researches at different scales, as well as in biology and structure studies of different microbial populations, pathogenicity analysis and bacterial evolution. In the present work, the main typing schemes based on this methodology for the study of hemoparasites that affect cattle.

Key words: molecular markers, multi-locus sequence typing, PCR, hemoparasites, cattle.

INTRODUCCIÓN

Actualmente, el número de genomas bacterianos pertenecientes a importantes patógenos de interés clínico y veterinario, secuenciados completamente, aumenta a un ritmo acelerado debido a la expansión en la capacidad de procesamiento de la información que brindan las nuevas tecnologías de secuenciación de última generación (3).

La disponibilidad de estas secuencias, depositadas en bases de datos universales de libre acceso, ha provocado considerable interés para el desarrollo y la evaluación de metodologías en la identificación, localización y prevención de la propagación de agentes infecciosos. Los métodos basados en el análisis de secuencias de ADN han ganado un interés creciente en la búsqueda de métodos de tipificación más rápidos y menos laboriosos, ya que estos permiten la obtención de un resultado concreto fácilmente portable e intercambiable, ofreciendo una excelente reproducibilidad tanto a nivel intra como interlaboratorio (4).

Varios métodos se han desarrollado para la tipificación de microorganismos patógenos, que difieren en poder discriminativo, reproducibilidad y complejidad en la interpretación de los resultados (5,6).

En la actualidad, uno de los métodos más prometedores es la tipificación multilocus de secuencias [de sus siglas en inglés, Multi-locus Sequence Typing (MLST)]. Esta metodología se desarrolló por Maiden et al. (2) a finales de la década del 90, basada en la secuenciación de fragmentos de siete genes conservados “housekeeping” que no se encuentran sometidos a presión selectiva, donde las variaciones en los diferentes locus se detectan de forma directa mediante el análisis de las secuencias obtenidas, lo que permite la identificación de grupos de microorganismos con genotipos idénticos (clones) o altamente relacionados (líneas clonales) (2).

Durante la estandarización de esta metodología se observó que algunas regiones específicas de los genes analizados eran responsables de la mayor parte de la variabilidad observada, mientras que el resto del locus presentaba un alto grado de conservación; por tanto, se decidió analizar en cada gen solo un fragmento interno de 450-500 pb, cuyo nivel de variabilidad, combinado entre los genes analizados, proporciona un alto grado de discriminación (7).

La propuesta de MLST como una metodología universal fue posible por tres avances en microbiología molecular: (i) perfeccionamiento en el conocimiento sobre la evolución y biología de las poblaciones bacterianas (2); (ii) incremento en la disponibilidad y disminución del alto costo de los servicios de secuenciación de nucleótidos (8); (iii) la evolución de la tecnología de la información, en particular el desarrollo de Internet como un medio eficiente, instantáneo y rentable de intercambio de información (9). Esta metodología posee la deseable combinación de poder discriminatorio, reproducibilidad y fácil intercambio de resultados entre laboratorios alejados geográficamente.

En la última década han surgido otras técnicas basadas en la comparación de múltiples locus, entre las que se destaca el análisis multilocus de repeticiones en tándem de número variable [de sus siglas en inglés, Multiple Locus Variable Number Tandem RepeatsAnalysis (MLVA)], que se basa en el análisis multilocus de secuencias polimórficas repetidas en tándem (VNTR).

Los estudios comparativos entre MLVA y MLST han dado resultados similares (10), aunque en especies emergentes el enfoque MLVA ha mostrado mayor poder discriminatorio (11). Esta técnica comparte todas las ventajas del esquema MLST en términos de portabilidad y reproducibilidad a un costo menor, pero las regiones VNTR pueden evolucionar demasiado rápido para proporcionar relaciones filogenéticas confiables entre cepas estrechamente relacionadas, y la diferencia de tamaño no siempre puede reflejar el número real de repeticiones en tándem debido a la presencia de inserciones y deleciones (12). También ha tenido gran importancia el método de tipificación multilocus de secuencias ribosomales [de sus siglas en inglés, Ribosomal Multi-locus Sequence Typing (rMLST)], que analiza la variación molecular entre los 53 genes que codifican para las subunidades de los ribosomas bacterianos (3).

Este nuevo método persigue la integración de un método taxonómico y de tipificación en un esquema MLST. Este método no requiere de un genoma secuenciado, los loci blanco de análisis se conservan en todo el dominio de las bacterias y no es necesario el reanálisis de las designaciones de alelos existentes (13). Aunque es más costoso, el rMLST probablemente proporcione una mejor resolución que las metodologías anteriores, que con la disminución en un futuro de los costos de secuenciación de ADN hacen que sea una técnica prometedora. El método aún requiere perfeccionar algunos aspectos, pero ciertamente tiene el potencial de proporcionar un método de tipificación bacteriana universal extendiendo la idea del esquema MLST.

Anaplasma marginale

Anaplasma marginale es el agente causante de la anaplasmosis bovina, una enfermedad presente en regiones tropicales y subtropicales del mundo, transmitida por garrapatas, donde Rhipicephalus microplus se considera como el vector biológico de mayor importancia. Esta rickettsia es un parásito intracelular obligado de eritrocitos bovinos, que provoca severas pérdidas económicas en las regiones tropicales y subtropicales (14).

Varios métodos y marcadores moleculares se han desarrollado para caracterizar la diversidad genética de A. marginale; estos se centran fundamentalmente en las regiones variables de las principales proteínas de superficie (MSP) MSP1a y MSP4, las cuales son útiles para discriminar aislamientos (15-17). Estrada-Pena et al. (18) describen la variabilidad de la secuencia de la proteína de membrana MSP1a en aislamientos de todo el mundo e informan que este marcador molecular está asociado solo a regiones ecológicas, lo cual infiere que la evolución de A. marginale puede estar relacionada con rasgos ecológicos que afectan los vectores. Por tanto, es necesario desarrollar métodos precisos para la genotipificación y caracterización de aislamientos, tanto para el estudio de la estructura como la dinámica de las poblaciones de A. marginale.

Recientemente, Guillemi et al. (19) describieron el desarrollo y la evaluación del primer ensayo MLST para A. marginale y su aplicación para los estudios de estructura de la población. El diseño de este ensayo fue posible debido a la disponibilidad de la secuencia del genoma completo de A. marginale y se aplicó en el estudio de 58 aislamientos de diferentes regiones del mundo, teniendo en cuenta los resultados publicados previamente por Estrada-Pena et al. (18) y Ruybal et al. (20). Este estudio se realizó utilizando genes aplicados para otros ensayos MLST en microorganismos relacionados (21), previamente descritos en la literatura como genes de referencia; estos son genes de copia única y codifican para proteínas conservadas (22). Finalmente se eligieron siete genes que se encuentran distribuidos homogéneamente a través del genoma: dnaA, ftsZ, groEL, lipA, recA, secY y sucB.

Entre los genes analizados se identificó una alta diversidad de nucleótidos (Si = 0,9958) con un alto número de STs por cepa (52 STs en 58 cepas), mientras que la proporción Ka/Ks mostró una gran proporción de sustituciones similares, indicativo de selección negativa. Estos resultados están acorde con lo que se espera en una bacteria intracelular obligada, ya que este tipo de organismo puede mostrar un equilibrio genómico después de la adaptación al parasitismo intracelular (23). Además, se detectaron eventos de recombinación en casi todos los genes, lo cual junto con la coexistencia de más de una cepa de A. marginale en un mismo hospedero, podría sugerir que el fenómeno de superinfección es una fuente potencial de variación en la población. En algunos casos se encontraron secuencias parentales y se identificó un patrón de recombinación de sustitución. Recientemente, la recombinación homóloga se convirtió en evidente por los resultados de estudios MLST obtenidos en organismos relacionados como Orientia tsutsugamushi (24) y A. phagocytophilum (25).

El análisis de los perfiles alélicos realizado a través del programa goeBURST muestra la existencia de dos complejos clonales principales sin una asociación evidente entre regiones geográficas y genotipos, ya que las secuencias tipo provenientes de diferentes regiones fueron agrupadas en un mismo complejo clonal. Por otro lado, la prueba AMOVA confirmó la aparición de al menos dos grupos principales genéticamente divergentes. Finalmente, se concluyó que la composición de estos grupos refleja el impacto de rasgos de corte históricos y ambientales en la estructura de la población A. marginale (19).

El desarrollo y la evaluación de este primer ensayo MLST para A. marginale permitió diferenciar los 58 aislamientos, con un alto poder de discriminación, y estimar algunos parámetros básicos de biología poblacional, incluyendo los índices de diversidad y el impacto del proceso de recombinación homóloga.

Anaplasma phagocytophilum

Anaplasma phagocytophilum es una bacteria Gram negativa, intracelular obligada, que se replica en el interior de los neutrófilos (26). Esta rickettsia se considera un patógeno de importancia veterinaria con un amplio rango de hospederos y se reconoce como el agente causante de la fiebre transmitida por garrapatas en ganado bovino, caprino y ovino, así como la anaplasmosis granulocítica canina, equina y humana (27); esta última es una zoonosis de importancia clínica clasificada como una enfermedad emergente (28).

Entre los marcadores moleculares empleados con mayor frecuencia en estudios de caracterización filogenética de nuevos aislados de A. phagocytophilum se destacan los genes ARNr 16S, groESL, ankA, msp2 y msp4 (31). Todos estos genes, con excepción del gen ARNr 16S, han revelado altos niveles de diversidad genética, pero a menudo los estudios filogenéticos, basados en un único gen variable, producen resultados inconsistentes (32).

Huhn et al. (25) desarrollaron un ensayo MLST con el objetivo de realizar un análisis de la estructura poblacional de A. phagocytophilum y determinar específicamente cuáles cepas de este patógeno circulan en las diferentes especies de animales hospederos, así como cuáles especies de animales salvajes son reservorios potenciales para la transmisión de la anaplasmosis granulocítica, tanto en humanos como en animales de granja y de compañía en el continente europeo.

Se analizaron 380 muestras positivas para A. phagocytophilum procedentes de humanos, animales y garrapatas I. ricinus; también se incluyeron en el estudio 11 muestras procedentes de Estados Unidos. Para el desarrollo de este estudio los siete genes conservados seleccionados fueron pheS, glyA, fumC, mdh, sucA, dnaN y atpA, los cuales se encuentran distanciados al menos 10 kb en el genoma de A. phagocytophilum HZ disponible en el GenBank con número de acceso CP000235. También se realizó una caracterización molecular basada en los genes ARNr 16S y ankA, con la finalidad de evaluar la concordancia entre los resultados obtenidos por MLST y la genotipificación basada en el análisis de secuencia de un único gen variable (25). 

Los resultados en este estudio infieren que las cepas de A. phagocytophilum procedentes de humanos, perros, caballos, jabalíes y puerco espín son homólogas, ya que, a diferencia de las cepas procedentes de Estado Unidos, estas pertenecen a un mismo complejo clonal y se agrupan juntas en el análisis filogenético basado en el gen ankA. Estos resultados se corresponden con estudios previos realizados en el viejo continente, donde aislamientos de A. phagocytophilum en humanos, canes y equinos se agrupan juntos en los análisis filogenéticos basados en los genes groESL (33) y ankA (32). 

Otro resultado interesante fue la incapacidad del gen ARNr 16S para diferenciar entre aislamientos europeos y norteamericanos, basado en el análisis filogenético de secuencias, a diferencia del ensayo MLST donde ninguno de los aislamientos compartió alelos en común y se demostró diversificación transcontinental. Por tanto, los estudios genotípicos con el gen ARNr 16S requieren la combinación con otro loci como genes de referencia o el gen ankA, ya que por sí solo no tiene suficiente valor de discriminación (34).

La principal desventaja del MLST desarrollado puede estar en la posibilidad de la ocurrencia de infecciones múltiples de un mismo hospedero con diferentes cepas de A. phagocytophilum, lo cual ocurre frecuentemente y es un fenómeno que ha sido descrito previamente en otras especies de mamíferos domésticos y salvajes (35).

Huhn et al. (25) concluyeron que animales de vida salvaje, como el jabalí y el puerco espín, pueden actuar como reservorios en la transmisión de la anaplasmosis granulocítica en humanos y animales domésticos, ya que los aislamientos de A. phagocytophilum procedentes de estas especies se agrupan en un mismo complejo clonal. No obstante, a pesar de que este análisis del tipo MLST pueda ser afectado por la ocurrencia de infecciones múltiples en un mismo hospedero, este esquema constituye una valiosa herramienta para investigar la variación genética en A. phagocytophilum.

Ehrlichia ruminantium

Ehrlichia ruminantium es el agente causal de la hidropericarditis o cowdriosis, una enfermedad fatal en rumiantes, transmitida por garrapatas del género Amblyomma. Esta enfermedad es endémica en países de África subsahariana, Madagascar y algunas islas del Caribe, desde donde representa una amenaza para el continente americano en regiones donde están presentes especies de vectores competentes (36).

Actualmente, se han desarrollado varios métodos y marcadores moleculares para caracterizar la diversidad genética de esta rickettsia, entre estos el gen map1 que codifica para la proteína de superficie MAP1 y muestra un elevado nivel de polimorfismo en su secuencia entre diferentes cepas (40). No obstante, aunque el análisis de secuencias del gen map1 permite caracterizar la diversidad genética entre aislamientos de campo, este no proporciona información fiable para el establecimiento adecuado de relaciones filogenéticas que permitan encontrar una correlación entre aislamientos (41).

Adakal et al. (21) desarrollaron un esquema MLST para E. ruminantium basado en ocho genes de referencia (gltA, groEL, lepA, lipA, lipB, secY, sodB, y sucA). Este método demostró tener una resolución lo suficientemente alta para discriminar, incluso, entre los genotipos estrechamente relacionados que circulan en Burkina Faso. Sin embargo, los perfiles alélicos de este esquema MLST disponibles fueron limitados a colecciones geográficamente restringidas. Por tanto, teniendo en cuenta la amplia distribución de E. ruminantium en todo el continente africano, se hizo necesario la expansión de una base de datos global para incluir nuevos genotipos de diferentes orígenes geográficos, así como determinar la utilidad de este método para la detección de genotipos que circulan en zonas endémicas de cowdriosis (42).

Para alcanzar estos objetivos, Nakao et al. (43) analizaron un panel de 17 cepas de referencia de orígenes geográficamente diversos y ocho muestras de garrapatas Amblyomma variegatum positivas para E. ruminantium procedentes de Uganda. Todos los loci MLST fueron amplificados con éxito en las 25 muestras y se identificaron 21 secuencias tipo (ST), de las cuales 19 fueron de nuevo reporte.

Con estos resultados, Nakao et al. (43) infieren que las STs obtenidas son de cepas recombinantes originarias de países de África occidental. Una posible explicación para esta restricción regional es que los eventos de recombinación no se pudieron detectar correctamente, debido a la toma parcial de muestras o a los bajos niveles de diversidad genética entre las cepas analizadas. Por tanto, aún es necesario continuar compilando datos en el esquema MLST, especialmente de aquellas cepas que circulan en países del este y el sur de África, los cuales serán de gran valor para la comprensión de la función que desempeña la recombinación en la evolución del genoma bacteriano, a fin de proporcionar una visión general sobre la situación actual de la diversidad genética de E. ruminantium en los países africanos.

Podemos concluir que los eventos de recombinación identificados en este estudio demuestran que un método genotípico de múltiples locus, en lugar de los métodos basados en caracterizar un único gen, constituye un requisito previo para una adecuada comprensión de las relaciones filogenéticas de E. ruminantium. El hecho de que el esquema MLST empleado no consiguió discriminar entre dos cepas estrechamente relacionadas, pone de relieve la necesidad de mejorar dicho esquema o desarrollar otros métodos genotípicos de múltiples locus con poder de resolución superior, tales como el MLVA.

Babesia bovis y Babesia bigemina

Los protozoarios Babesia bovis y Babesia bigemina son los agentes etiológicos de la babesiosis bovina, una enfermedad de importancia veterinaria que afecta notablemente la producción ganadera en regiones tropicales y subtropicales del mundo, donde Rhipicephalus microplus constituye el principal vector (44). Ambas especies de Babesia parasitan los eritrocitos del huésped mamífero asegurando la supervivencia a través de la reproducción asexual y la transmisión efectiva a su vector artrópodo. La fase aguda de la enfermedad se caracteriza por fiebre, anemia, hemoglobinuria e ictericia, lo cual resulta en altas tasas de mortalidad en rebaños susceptibles (45). Los costos debido a esta enfermedad no solo están relacionados con la mortalidad, abortos, pérdidas en la producción de leche y carne, sino también con costos atribuidos a la toma de medidas de control como los tratamientos acaricidas, la compra de vacunas y antiparasitarios (46).

Guillemi et al. (47) desarrollaron dos esquemas de MLST, utilizando fragmentos de secuencias de seis genes (cyp, dnaJ, sbp3, sbp4, rcc y zfc) para B. bigemina y siete (gpad, check, dnaJ, pkid, rcc, rip9 y rho4) para B. bovis, con el fin de caracterizar molecularmente un conjunto de cepas de referencia y de campo con diferentes características fenotípicas y origen geográfico. El diseño de dicho esquema de MLST fue posible, en gran medida, a la disponibilidad de la secuencia del genoma completo de B. bovis y del genoma parcialmente terminado de B. bigemina.

Para la evaluación de ambos esquemas MLST, Guillemi et al. (47) trabajaron con 10 cepas de B. bigemina y 14 cepas de B. bovis. Durante el proceso de secuenciación se visualizaron picos de nucleótidos dobles superpuestos sobre las secuencias de los cromatogramas para ambas especies de Babesia. Los autores concluyeron que estos picos dobles encontrados solo se pueden atribuir a la presencia de infecciones mixtas con diferentes genotipos, ya que ambas especies de Babesia son haploides y todos los loci seleccionados fueron de copia única. En ambos hemoparásitos se encontró un alto nivel de diversidad de nucleótidos, con una relación ST/Cepa de 1 para B. bovis y 0,83 para B. bigemina. Simuunza et al. (48) obtuvieron resultados similares en un estudio previo sobre B. bovis, en el cual se logró un único genotipo multilocus, atribuyendo la recombinación como la principal causa de este fenómeno.

El programa goeBURST se empleó para dividir dos conjuntos de cepas en complejos clonales por comparación de sus perfiles alélicos. Este análisis indicó que solo dos aislamientos de B. bovis se relacionan estrechamente con el establecimiento de un único complejo clonal (ST11 y ST12) dentro de la colección estudiada. Este complejo clonal fue construido como consecuencia de que ambos aislamientos comparten seis de los siete loci en estudio. Estas cepas también comparten un origen geográfico y epidemiológico común, ya que corresponden a aislamientos de un brote de babesiosis en la provincia Corrientes, Argentina. El hecho sugiere que la falta de una estructura de población más general se deba, probablemente, al hecho de que la mayoría de los aislamientos proceden de muestras no relacionadas (47).

En resumen, ambos esquemas MLST desarrollados por Guillemi et al. (47) constituyen una tecnología robusta, objetiva y fácilmente adaptable para analizar diversos aspectos de la diversidad genética y la estructura poblacional de parásitos del género Babesia. Además, debe realizarse el análisis de un mayor número de muestras, para llegar a conclusiones definitivas sobre la prevalencia o ausencia de ciertos genotipos en regiones geográficas definidas. La posible aplicación de estos marcadores puede incluir la comparación a nivel mundial de diferentes poblaciones de cepas, el diseño de vacunas de subunidades, la caracterización de líneas de hemoparásitos utilizados para la producción de vacunas vivas y las comparaciones entre las cepas provenientes de ganado y aquellas que se encuentran en animales salvajes.

Bases de datos para MLST

Existen bases de datos para cada microorganismo en el que se ha desarrollado un esquema MLST, accesibles mediante las páginas web http://mlst.net (50) y http://bioinformatica.inta.gov.ar/galaxy; esta última da acceso al pipeline denominado “Galaxy MLST-Pipeline” desarrollado por Guillemi et al. (19) para el caso particular de A. marginale, B. bovis y B. bigemina. Estos sitios funcionan como nexo común para todos los posibles participantes, puede realizarse todo el proceso de consulta y análisis, así como enviar las propias cepas para inclusión en las bases de datos con libre acceso.

El programa de gestión de la base de datos permite al usuario realizar consultas de alelos, de perfiles alélicos y de aislados específicos con el objeto de conocer su relación con otros aislados incluidos en la base. Adicionalmente, la página web ofrece enlaces con un buen número de programas que permiten el análisis de datos generados por MLST mediante la utilización de diversos algoritmos.

CONCLUSIONES

MLST ha jugado un papel importante en el diagnóstico y la caracterización de patógenos de interés clínico y veterinario. El control efectivo de estos depende, en gran medida, de la capacidad de realizar el diagnóstico rápido y confiable de los agentes etiológicos involucrados en los brotes infecciosos. MLST ha demostrado ser un método genotípico de alta resolución que proporciona datos fiables para realizar análisis filogenéticos de estructura y evolución de las poblaciones bacterianas; sin embargo, con la disminución en el costo de los servicios de secuenciación de genomas completos, la tendencia es hacia la comparación de las secuencias de diferentes genomas.

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Recibido: 20/1/2017

Aceptado: 18/6/2017

*Autor para correspondencia: Belkis Corona-González. E-mail: bcorona@censa.edu.cu