Efecto de aislados de Rhizobium sobre parámetros fenotípicos y la fijación de nitrógeno en genotipos de frijol común (Phaseolus vulagris L.)
Rhizobium isolated effect on phenotypic parameters and nitrogen fixation in common bean genotypes (Phaseolus vulagris L.)
Klever Iván Granda Mora1, Ariany Colás Sánchez2, Yenisey Gutiérrez Sánchez3, René Cupull Santana2, Yelenys Alvarado Capó4 y Roldán Torres Gutiérrez1
1- Centro de Biotecnología, Universidad Nacional de Loja. Ciudadela Guillermo Falconi. “La Argelia” - PBX: 072547252 - Casilla Letra “S”, Loja, Ecuador. CP 110150. ]]>
2- Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5, Santa Clara, Cuba. CP 54830.
3- Departamento de Contaminación microbiana. Instituto Nacional de Viandas Tropicales. Carretera Central km 33. Santo Domingo. Cuba.
4- Instituto de Biotecnología de las Plantas. Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. Carretera a Camajuaní km 5,5, Santa Clara, Cuba. CP 54830.
E-mail:roldan.torres@unl.edu.ec; arianycs@uclv.edu.cu; contam.biotec@inivit.cu; yelenys@ibp.co.cu
RESUMEN
]]> El presente trabajo se llevó a cabo con el objetivo de determinar el efecto de aislados de Rhizobium previamente caracterizados e identificados genéticamente sobre los parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno de genotipos de frijol común. El análisis fenotípico de los aislados se condujo en condiciones controladas, evaluándose los parámetros de nodulación, morfológicos, fisiológicos y la fijación de nitrógeno de los genotipos ICA Pijao y BAT-304 de frijol común. Los resultados obtenidos demuestran que las cepas aisladas de Rhizobium tienen habilidad para formar una cantidad abundante de nódulos en las raíces de las plantas de frijol de los genotipos analizados. Se destacó el efecto beneficioso de la especie R. etli y los aislados procedentes de Santa Clara y Camajuaní-1, así como el aislado R. pisi de Camajuaní-2. La variabilidad genotípica demostró la estrecha correlación positiva entre esas cepas y el genotipo BAT-304 en comparación con ICA Pijao.Palabras clave: Rhizobium, caracterización fenotípica, frijol común, aislados.
ABSTRACT
The present work was carried out with the aim to determine the effect of Rhizobium isolates previously characterized and genetically identified on morphological and physiological parameters and the nitrogen fixation of common bean genotypes. The phenotypic analysis of isolates carried out under controlled conditions, where the nodulation, morphological and physiological parameters and the nitrogen fixation of the genotypes ICA Piajo and BAT-304 were evaluated. The results showed that the isolated strains have the ability for abundant nodule formation in roots plant of both genotypes analyzed. The remarkable beneficial effect was for R. etli specie and the isolates from Santa Clara and Camajuaní-1, as well as the isolated of R. pisi from Camajuaní-2. The genotypic variability showed the close positive correlation among these strains and the genotype BAT-304 compared with ICA Pijao.
Key words: Rhizobium, phenotypic characterization, common bean, isolates.
INTRODUCCIÓN
Dentro de las plantas leguminosas, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) presenta singular importancia por el aporte de altas cantidades de proteínas, carbohidratos y minerales (Quintero, 2000), el mayor aporte de proteínas viene dado por la habilidad que tiene este cultivo de establecer relaciones simbióticas con bacterias del suelo pertenecientes al género Rhizobium (Broughton et al., 2003).
El mayor beneficio de la interacción Rhizobium-leguminosa está estrechamente ligado a la disminución de la aplicación de fertilizantes nitrogenados y a la salud de las plantas, lo cual trae como resultado el incremento de los rendimientos agrícolas (Giller, 2001). Estos sistemas simbióticos aportan la mayor fuente de nitrógeno (N) a los agroecosistemas, incorporando como promedio un 80 % de los requerimientos de N mediante la fijación simbiótica del N (Graham y Vance, 2000). Sin embargo, los cultivos de leguminosas son muy variables en cuanto a su eficiencia para fijar dinitrógeno (N2) atmosférico, especialmente el cultivo del frijol común, el cual se considera por varios autores como ineficiente en este proceso, alcanzando niveles del 40 % del N derivado de la atmósfera (Remans et al., 2007, Torres-Gutiérrez, 2008).
]]> Torres-Gutiérrez et al. (2009) y Granda-Mora et al. (2009) reportan la abundancia de cepas nativas del género Rhizobium en los suelos de la región central de Cuba, aisladas de nódulos de frijol común, e identificadas mediante métodos moleculares (16S rRNA). Estos autores identificaron varias especies, tales como: Rhizobium sp., R. tropici, R. etli, R. rizogenes y R. pisi, sin embargo, los estudios del efecto de estas cepas en genotipos de frijol común, ya sea para evaluar su incidencia sobre parámetros morfológicos, fisiológicos o el rendimiento agrícola de este cultivo, no se han llevado a cabo, es esa razón esta investigación tiene como objetivos dilucidar el efecto de cepas de Rhizobium sobre parámetros morfológicos y la fijación de N en los genotipos contrastantes de frijol común BAT-304 e ICA Pijao.
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se realizó en la Facultad de Ciencias Agropecuarias y el Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, sonde se realizaron ensayos con los genotipos contrastantes BAT-304 e ICA Pijao.
Las cepas bacterianas utilizadas en el ensayo fueron aquellas caracterizadas morfológicamente e identificadas genéticamente por Torres-Gutiérrez et al. (2009), las cuales se muestran en la (Tabla 1).
Preparación del inoculó, montaje del experimento e inoculación
Todas las cepas utilizadas se sembraron en medio Fred sólido (Manitol 10 g; MgSO47H2O 0,2 g; NaCl 0,1 g; CaCO3 0,5 g; K2HPO4 0,5 g; Extracto de levadura 0,5 g; Agar 15 g; esto para 1 L) durante 72 h e incubadas a 30 ºC. Para la preparación del preinóculo se dispuso de 10 ml de medio Fred modificado y se ajustó el pH a 7 añadiendo HCl. En este medio se sembraron las cepas previamente crecidas. Los tubos se incubaron a 30 oC durante 24 h en incubadora zaranda (Gerhardt, THO-500, Alemania) para contar con título mínimo de 108 ufc ml-1. Al cabo del tiempo establecido se inoculó el cultivo de cada cepa en 500 ml de medio Fred modificado para obtenerse el inóculo final, el cual se incubó a 30 ºC durante 24 h en la incubadora.
]]> Luego del tiempo necesario para el crecimiento de las bacterias se realizó el conteo de las células viables en cada una de los aislados. Todas las cepas contaron con títulos de 109 o 1010 ufc ml-1 para la realización de la inoculación de las semillas.En la fase de adaptación del IBP se realizó el ensayo, para el cual se dispuso de un diseño experimental totalmente aleatorizado con 10 réplicas por cada cepa objeto de análisis, además de un tratamiento control con la inoculación de la cepa tipo CNPAF-512 y un control sin inoculación de bacterias. Se depositaron dos bandejas de poliespuma de 96 hoyos, aunque solo se utilizaron para cada variedad un total de 80 hoyos, en los cuales se añadieron 200 g de zeolita inactiva como sustrato para el crecimiento de las plantas. En cada hoyo se sembraron las semillas de las variedades ICA Pijao y BAT-304, las que se inocularon con 1 ml de inóculo de cada cepa en el momento de la siembra. A las semillas del tratamiento control sin inoculación se les añadió 1 ml de agua.
Condiciones de crecimiento y evaluaciones
Las bandejas de poliespuma sembradas e inoculadas se colocaron en la cámara 5 de la casa de cultivo 1 del IBP, donde existía adecuada iluminación y se mantuvo el riego manual diario para evitar la desecación de la zeolita.
A los 21 días después de la siembra (DDS) se analizaron los parámetros morfológicos y fisiológicos de la nodulación: número de nódulos totales (NN) y peso fresco y seco de los nódulos (PFN, PSN en gramos) (FAO, 1995); además del contenido de biomasa de la raíz y el follaje: peso fresco y seco de la raíz (PFR, PSR) y el peso fresco y seco del follaje (PFF, PSF en gramos). Para los análisis se cosecharon todas las plantas, por lo que se dispuso de 10 muestras por cada tratamiento. El análisis de la biomasa se realizó en balanza (Explorer Pro, EP64, Suiza).
Luego del análisis del contenido de materia seca mediante el secado de la parte aérea de las plantas, se precedió determinar la fijación de N para cada tratamiento tomando dos réplicas como muestra. Este parámetro se realizó mediante el porcentaje de N total (% N total). Para esta determinación se utilizó el método Kjeldahl (1980), El cálculo del % N total se efectúa por la siguiente formula:
Donde:
% N= porcentaje de N total de la muestra
Vm= volumen de la muestra
VB= volumen del blanco (H2SO4 sin muestra) ]]>
PM= peso de la muestra
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizándose el paquete STATGRAPHIC® Plus ver. 5.0 sobre Windows. Para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos, los genotipos o la interacción de estos factores en los parámetros de nodulación y la biomasa de las plantas, se realizó un análisis de varianza multifactorial (Multifactor ANOVA), donde se determinó el grado de independencia de los tratamientos y las variedades, realizándose la prueba paramétrica Bonferroni con nivel de significación p<0,05.
Para correlacionar los parámetros de nodulación y la biomasa de las plantas se realizó un análisis de regresión lineal mediante coeficiente de correlación de Pearson (Pearson Linear Correlation) teniendo niveles de significación 0,01<p>0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En las (Figuras 1 y 2) se muestran los resultados de los parámetros de nodulación, referente al número de nódulos totales, el peso fresco, el peso seco de nódulos (g) por cada genotipo analizado y la comparación entre los genotipos en las diferentes variables evaluadas.
Como se observa en las figuras, todas las cepas aisladas fueron capaces de nodular las raíces de BAT-304 e ICA Pijao indicando la compatibilidad en la interacción micro y macrosimbionte. Para el genotipo ICA Pijao (Figura 1-A) se observan como mejores tratamientos la inoculación de los aislados procedentes de Santa Clara-Maleza y Sagua respectivamente (R. etli y R. pisi), los cuales defirieron significativamente con los de menores valores en la nodulación, los que correspondieron a la inoculación con R. pisi aislado de Camajuaní-2 y el control.
Para el genotipo BAT-304 (Figura 1-B) se observaron mayores números de cepas que lograron estimular la nodulación que para ICA Pijao. En este genotipo la inoculación con las cepas aisladas de Santa Clara-Maleza (R. etli), Cienfuegos (R. pisi), Camajuaní-1 (R.etli) y la cepa tipo CNPAF- 512 (R. etli) fueron los tratamientos de mejores resultados estadísticos, al diferir significativamente con el control. Se destaca que la diferencia de nódulos entre los tratamientos R. etli-Santa Clara-Maleza y el control asciende a 61,7 %, lo que evidencia la superioridad de la cepa en este genotipo.
]]> Sorprendentemente en las plantas pertenecientes al control se observaron nódulos en las raíces, este fenómeno pudo estar originado a que la zeolita utilizada no se esterilizó, por lo que pudo estar contaminada con bacterias pertenecientes al género Rhizobium, sin embargo, fueron los tratamientos de menores valores estadísticos para ambos genotipos.En la (Figura 2) se muestran los resultados para el peso fresco y seco de los nódulos (PFN y PSN). Este último parámetro es de gran importancia ya que sirve como indicador para estimar las tasas de fijación de N2 atmosférico por el cultivo de leguminosas, en condiciones de bajos insumos (Urquiaga y Zapata, 2000).
Para el genotipo ICA Pijao (Figura 2-A) no se observan grandes diferencias entre los tratamientos, obteniéndose el de mejores resultados para el peso fresco de los nódulos aquel donde se aplicó la cepa aislada de Cifuentes (R. pisi), mientras que para el peso seco de los nódulos la inoculación del aislado procedente de Sagua tuvo los mejores valores significativos. En ambas variables evaluadas la inoculación con la cepa R. pisi de Camajuaní-2 y el control obtuvieron los valores más bajos estadísticamente, comportándose de la misma forma que para la nodulación total.
Para BAT-304 (Figura 2-B) los valores también se comportaron muy relativos a los analizados en el número de nódulos totales. El peso fresco de nódulos se estimula con la inoculación de las cepas R. pisi-Cienfuegos y R. etli Camajuaní-1 y se observa que ambas difieren estadísticamente con el tratamiento control, el cual obtuvo el menor valor estadístico. La biomasa seca nodular en este genotipo demostró una correlación positiva con la nodulación, ya que el único aislado que tuvo diferencias significativas con el control fue el procedente de Camajuaní-1 (R. etli). Aunque los aislados R. etli-Santa Clara-Maleza y R. etli CNPAF-512 no tuvieron diferencias con el tratamiento control, se observa una tendencia al incremento de la biomasa seca nodular de 56,7 y 55 % respectivamente con ese tratamiento.
Según Dobbelaere et al. (2003) estas bacterias son capaces de excretar al medio donde se desarrollan abundantes cantidades de sustancias que son conocidas como estimuladoras del crecimiento vegetal, tales como auxinas, las cuales intervienen en la arquitectura radical y de este modo se facilita la invasión, colonización y la nodulación en interacciones eficientes. Recientemente Remans et al. (2008), reportaron diferentes QTLs (quantitative trait loccus) que ejercen un marcado efecto sobre la producción de auxinas en frijol común inoculado con la cepa R. etli CNPAF-512. Estos reportes se encuentran estrechamente relacionados con la estimulación de la producción de auxinas y la nodulación en frijol común (Remans et al., 2008; Torres-Gutiérrez, 2008).
La (Figura 3) muestra el análisis de la biomasa tanto para ICA Pijao y BAT-304. En cada cuadro de la figura se observa el peso fresco o seco del follaje y la raíz para ICA Pijao (A, C) y BAT-304 (B, D) respectivamente. De forma general se observa que existe mayor variabilidad para los parámetros fisiológicos de la raíz que para el follaje en ambos genotipos. Estas variables se ven más afectadas positivamente mediante la inoculación con aquellas bacterias que ejercen un marcado efecto sobre los parámetros de nodulación, lo cual puede estar relacionado con los mecanismos directos que realizan las sustancias excretadas por estas bacterias sobre el sistema radical y de modo indirecto sobre el follaje de las plantas, además del incremento de las tasas de N fijado al follaje como resultado de la eficiencia de la interacción.
Resultados similares a los obtenidos en el ensayo se reportan por Torres-Gutiérrez et al. (2004) al evaluar la biomasa del cultivo del frijol, donde no observan diferencias significativas en cuanto al peso fresco y seco del follaje en los tratamientos de inoculación combinada y la inoculación con Rhizobium en solitario.
La (Figura 4) muestra los valores obtenidos en la fijación de N mediante el porcentaje de N total. Con relación a ICA Pijao, los mejores resultados se obtienen con el aislado procedente de R. pisi-Sagua, este último conjuntamente la inoculación del aislado de R. pisi Cienfuegos tuvieron un incremento de 30,3 y 26,7 % respectivamente en comparación con tratamiento control.
En el genotipo BAT-304, se observa como el tratamiento R. pisi Camajuaní-2, R. etli-Santa Clara-Maleza y R. etli-Camajuaní-1 obtuvieron los mejores resultados en los niveles de fijación de N, al tener un incremento de 41,8, 37,6 y 35,1 % respectivamente frente al control. Los resultados obtenidos en estos últimos tratamientos demuestran una relación estrecha entre todos los parámetros evaluados, los cuales para ambos genotipos estimularon desde el análisis morfológico, hasta la nodulación, parámetros fisiológicos y la fijación de N, en especial para BAT-304.
]]> Las diferencias en la eficiencia de la FSN entre cepas de Rhizobium son consecuencia al menos de dos causas: i) estabilidad en el material genético involucrado en la fijación, el cual está sometido a frecuentes pérdidas por reordenamiento del mismo (Martínez et al., 1988) y ii) relación entre la capacidad para formar masa seca nodular, fijar N y transferir este a la parte aérea de las plantas (Dobereigner, 1988). Teniendo en cuenta estos aspectos se puede atribuir que la cepa R. pisi Camajuaní-2 para el genotipo BAT-304 es un caso típico de estabilidad en los genes nif involucrados en la fijación de N, aunque formó relativamente menos masa seca nodular que la cepa aislada de Camajuaní-1, fue capaz de fijar y transformar adecuadas tasas de N.En las (Tablas 2 y 3) se muestran los valores obtenidos mediante el análisis de correlación de Pearson p<0,05 entre las diferentes variables evaluadas tanto para los parámetros de fijación y parámetros fisiológicos bajo condiciones controladas esto con respecto para cada variedad estudiada.
Para BAT-304 se observan correlaciones significativas entre todas las variables evaluadas, siendo las más importantes de nuestro estudio el número de nódulos totales, peso seco de nódulos, y el peso seco del follaje, quienes correlacionan positivamente entre si, entre NN y el peso seco de los mismos 52 %, mientras que entre el número de nódulos totales y PSF un 34 %. Inverso a esto sucede para ICA Pijao donde no todas las variables evaluadas tienden a correlacionarse positivamente entre si, tal es el caso entre peso seco de la raíz con el número de nódulos, donde la misma es negativa. Los valores más significativos para esta variedad se presentan entre PSN-PFN con un 77 %, seguido por PFN-NN con 68 %, y PSR-PFR con un 63 %, el resto de los valores siendo menos significativos. A pesar de que esos valores son significativos para las variables, los valores en los parámetros de fijación son menos significativos al compararlos con BAT-304 donde los mismos se presentan mejor en esta variedad que los reportados para ICA Pijao, esto nos da la pauta que al existir un mayor número de nódulos totales existirá mayor materia nodular y por consiguiente, el incremento de la fijación de N2, dando como resultado el aumento en la materia seca de la parte aérea y radicular de las plantas, esto al corroborar la correlación positiva entre el peso seco de los nódulos y el peso seco del follaje, así como el peso fresco de raíz y peso fresco de nódulos, lo que no sucede para ICA Pijao. Frente a esto podemos concluir diciendo que la inoculación de aislados de Rhizobium afecto positivamente en el crecimiento, desarrollo y fijación de N2 en las dos variedades de frijol, pero sobre todo en BAT-304.
CONCLUSIONES
1. Mediante los ensayos realizados y los resultados obtenidos, se demuestra que todas las cepas aisladas son capaces de formar nódulos en las raíces de los genotipos ICA Pijao y BAT-304. En los parámetros de nodulación se destacan las cepas R. etli-Santa Clara-Maleza y R. pisi-Sagua para ICA Pijao, mientras que para BAT-304 los mejores aislados fueron R. etli-Santa Clara-Maleza, R. etli-Camajuaní-1, R. etli-CNPAF-512 y R. pisi-Cienfuegos.
2. La variabilidad genotípica en todos los parámetros evaluados se vieron afectados positivamente para BAT-304, no siendo así para ICA Pijao. Los mejores resultados globales se establecen por combinaciones cepas-genotipo (R.pisi-Sagua-ICA Pijao, R. pisi-Cifuentes-ICA Pijao, R. etli-Santa Clara-Maleza-BAT-304, R. etli-Camajuaní-1-BAT-304 y R. pisi-Camajuaní-2-BAT-304), por lo quepuede inferirse que para el genotipo ICA Pijao los aislados identificados como R. pisi tuvieron los mejores resultados estadísticos, mientras que para BAT-304 fueron aquellos identificados como R. etli.
3. Estos resultados ponen de manifiesto la posibilidad de usar las cepas de diazótrofos identificadas para la realización de inoculantes, sin embargo, se requieren de estudios en condiciones de campo para la validación de sus potencialidades.
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]]>Recibido: 15/09/2015
Aceptado: 10/12/2015
