Microrganismo y material vegetal empleado. Se utilizó la especie Bradyrhizobium elkanii, cepa ICA 8001, proveniente de la colección del Instituto de Ciencia Animal (ICA), ubicado en Catalina, La Habana. Para la obtención del extracto acuoso se empleó la especie Glycine max (soya), variedad Incasoy 27.
Medios de cultivo. Se utilizaron los medios de cultivo Agar manitol extracto de levadura y Bradyfact (9). Dada la importancia de este último medio en la investigación, a continuación se detalla su composición (g.L-1): melaza 5,0; (NH4)2 SO4 0,5; K2HPO4 3 H2O 0,5; MgSO4.7H2O 0,2; NaCl 0,1; CaCO3 1,0 y extracto acuoso de soya (mL) 10.0. El extracto acuoso de soya se obtuvo a partir de la decantación y filtración de una disolución de 100 g de semillas molidas en un litro de agua destilada, la cual se agitó durante dos horas a 300 rpm en un agitador magnético y posteriormente se dejó en reposo durante el mismo tiempo.
La melaza utilizada provino del complejo agroindustrial “Héctor Molina”, provincia La Habana.
Condiciones de cultivo. Para la obtención de los pre-inóculos se partió de tubos de vidrio con medio Agar manitol extracto de levadura más indicador rojo congo en plano inclinado con Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, cultivados durante una semana. Erlenmeyers de 250 mL con 50 mL de medio Bradyfact se inocularon con tres asadas de los tubos y se cultivaron durante 60 h. Pasado este tiempo, la biomasa microbiana fue inoculada al 8 % (v/v) en Erlenmeyers de 500 mL, con un volumen efectivo de medio de cultivo de 100 mL. Todas las fermentaciones se llevaron a cabo en zaranda orbital BIOZART 2013 a una velocidad de rotación de 100 rpm y una temperatura de 28 ± 2oC; los tiempos de cultivo variaron según el objetivo de cada experimento. ]]> Determinación del crecimiento microbiano. El crecimiento se determinó por la concentración celular a través de la absorbancia de los cultivos, a una longitud de onda de 600 nm en un espectrofotómetro uv/visible Genesys 10 uv. Se utilizó como blanco el medio de cultivo Bradyfact sin inocular.
Caracterización nutricional de la melaza y del molinado de semillas de soya. Para la determinación de las concentraciones de carbohidratos totales solubles presentes en estos dos componentes, se empleó el método descrito (10) y la determinación de la concentración de carbohidratos reductores (CHR) se desarrolló a través de la metodología descrita (11). Los contenidos de N, P, K, Ca, Mg y Na se determinaron según el Manual de técnicas analíticas para la caracterización de abonos y suelos (12).
Influencia de la concentración de melaza sobre la velocidad específica de crecimiento de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001. El estudio de la influencia de la concentración de melaza sobre la velocidad específica de crecimiento del microrganismo fue realizado con el medio Bradyfact, con concentraciones entre 3 y 20 g.L-1. Se tomaron alícuotas de 2 mL cada 8 h, lo que permitió obtener las dinámicas de crecimiento para cada variante mediante la determinación de la absorbancia a una longitud de onda de 600 nm.
La velocidad específica de crecimiento m(h-1) se calculó en la fase exponencial del crecimiento, utilizando el modelo de crecimiento no restringido (13). Para el cálculo se escogieron los mismos tiempos en todos los perfiles de fermentación.
Para calcular los parámetros cinéticos se empleó el modelo de Monod (13), que está descrito por la siguiente ecuación:
Influencia de la concentración de extracto acuoso de soya sobre la velocidad específica de crecimiento de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001. Para evaluar el efecto de este componente del medio de cultivo sobre la velocidad específica de crecimiento de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, se siguieron las mismas condiciones y métodos que para la melaza, solo que las concentraciones de extracto acuoso de soya en el medio Bradyfact variaron entre 5 y 20 g·L-1.
Diseño de experimentos y análisis estadísticos. Se utilizaron diseños completamente aleatorizados para la concepción de todos los experimentos. Todos los datos se sometieron a la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov y homogeneidad de varianza de Bartlett.
Los experimentos se realizaron con tres repeticiones. Se hizo el análisis de varianza de clasificación simple y la prueba de comparación de medias de rangos múltiples de Duncan, en la cual las medias que no se diferencian se expresan con igual letra. Los datos fueron procesados con los paquetes estadísticos Statgraphics plus 5.0 y Excel 7.0 para Windows. ]]> Resultados y Discusión
Caracterización nutricional de la melaza y el molinado de semillas de soya. Debido a la crucial importancia que juegan las melazas y los extractos de semillas en la nutrición microbiana (5, 14, 15, 16), estos compuestos son considerados macronutrientes y presentan un elevado potencial como materias primas de bajo costo para numerosos procesos fermentativos a nivel industrial.
En la Tabla I se muestran los resultados del análisis químico realizado a la melaza y al molinado de semillas de soya. Esta caracterización mostró cantidades apreciables de elementos asimilables por la bacteria durante su crecimiento celular. Ambos componentes contienen concentraciones considerables de carbohidratos solubles, nitrógeno, fósforo y un adecuado balance de los cationes: Na+, K+, Mg2+ Ca2+.
En el caso de la melaza, se apreció una concentración elevada de carbohidratos totales solubles de un 46 %, cifra muy cercana al valor promedio informado para las mieles cubanas de un 47 % (17), así como de carbohidratos reductores en comparación con el extracto de soya, el cual se destacó por presentar un alto contenido de nitrógeno.
Estos componentes aportan las siguientes concentraciones, según las proporciones en que se encuentran en el medio de cultivo Bradyfact (g.L-1): 2,54 de CHTS; 1,75 de CHR; 0,617 de nitrógeno; 0,067 de fósforo; 0,14 de Ca2+; 0,047 de Mg2+ y trazas de Na+ y K+.
Debido a la alta concentración de carbohidratos presentes en estos componentes del medio de cultivo (5, 17), se realizó un estudio de los parámetros cinéticos de la cepa frente a estos sustratos, con el objetivo de conocer si ocurría inhibición del crecimiento por exceso de sustrato a determinadas concentraciones de dichos elementos.
Influencia de la concentración de melaza sobre la velocidad específica de crecimiento de Bradyrhizobium elkanii cepa ICA 8001. A continuación se muestran los resultados del estudio cinético del crecimiento de la cepa ICA 8001 frente a diferentes concentraciones de melaza (Figura 1).
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En este caso se pudieron apreciar dos comportamientos diferentes. Para el rango de concentraciones de melaza entre 3 y 10 g.L-1 se encontraron los máximos valores de velocidad específica de crecimiento (µ), correspondiéndose con una zona de saturación, debido a que dichas velocidades no difieren significativamente entre ellas. Cuando los valores de concentración superan los 10 g·L-1, los valores de µ disminuyen significativamente desde 0,073 hasta 0,047 h-1. Este resultado reveló que valores de concentración inicial de melaza superiores a 10 g.L-1 afectan la velocidad específica de crecimiento de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001.
Muchos géneros bacterianos expresan un mecanismo de inhibición del crecimiento provocado por altas concentraciones de carbohidratos, debido a que los complejos enzimáticos responsables del transporte al interior de la célula pueden llegar a saturarse (18).
Por ejemplo, se observó la inhibición del crecimiento de una cepa de Rhizobium tropici cuando se utilizaron concentraciones iniciales de sacarosa en el medio mayores de 13 g.L-1 (19).
Para la producción de poli-b-hidroxibutirato (PHB) por Alcaligenes eutrophus se empleó la melaza de caña como suplemento nutricional. La adición de este componente a un medio sintético, a una concentración de 3 g.L-1, estimuló tanto la formación de biomasa como la producción de PHB. Sin embargo, cuando se suplementó con una concentración de 5 g.L-1, se evidenció un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de este microrganismo (20).
Este fenómeno de inhibición también pudo ocurrir, debido a que las mieles de caña presentan elementos que resultan indeseables para el crecimiento celular, por su actividad inhibitoria, como suelen ser los ácidos fenólicos, ácidos orgánicos volátiles y ácidos grasos.
Entre los modelos matemáticos que describen el crecimiento microbiano, los más simples son los no estructurados y no segregados; el modelo de Monod es un ejemplo. Estos modelos matemáticos juegan un papel fundamental en las investigaciones actuales, porque contribuyen al ahorro de tiempo, ya que permiten calcular determinados parámetros cinéticos y, a su vez, la predicción de los resultados a obtener.
Los datos obtenidos para la cepa ICA 8001 no se ajustaron a los modelos de inhibición encontrados en la literatura. Para determinar los parámetros cinéticos, fue necesario proponer un modelo que fuera una modificación del modelo de Monod para la zona de inhibición y que permitiera explicar matemática y fisiológicamente el comportamiento de la µ de la cepa respecto a la concentración de melaza en nuestras condiciones experimentales.
El modelo de Monod clásico se ajustó a la zona donde no existe inhibición, hasta concentraciones de melaza de 10 g.L-1 y se pudo determinar la constante de afinidad por el sustrato (Ks=0,162 g.L-1) y la velocidad máxima de crecimiento (mmax=0,077h-1).
Para la zona de inhibición se realizó una modificación, como se presenta en la siguiente ecuación: ]]>
Donde a corresponde al término de inhibición y está en función de la concentración inicial de sustrato (S), la constante de inhibición del sistema (Ki) y el coeficiente de inhibición (n)
A partir de la ecuación y=1.476x-1.858 obtenida del gráfico lnS (y) vs lnS (x), se determinó la Ki=6,409 y el n=1,477 del sistema.
El modelo propuesto se presenta en la siguiente ecuación:
En la Figura 2 se muestran los resultados experimentales y los obtenidos a partir del modelo para la cepa estudiada.
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El modelo correlaciona con un valor r2= 0,993, los valores experimentales de µ y los obtenidos por el modelo propuesto.
Influencia de la concentración de extracto acuoso de soya sobre la velocidad específica de crecimiento de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001. En la Figura 3 se muestra el comportamiento de la velocidad específica de crecimiento (µ) con respecto a la concentración inicial de extracto acuoso de soya en el medio de cultivo Bradyfact.
Al igual que en el caso de la melaza, se encontraron comportamientos diferentes. Entre 7,5 y 12,5 g.L-1 de extracto acuoso de soya, se observaron los más altos valores de µ y no se apreció una variación significativa entre ellos. Tanto para las menores concentraciones del extracto, 3 y 5 g.L-1, como para los valores por encima de 12,5 g.L-1, se obtuvieron µ significativamente inferiores.
En el caso del extracto acuoso de soya ocurrió el mismo fenómeno de inhibición que presentó la melaza, pues la velocidad específica de Bradyrhizobium elkanii, cepa ICA 8001, disminuye significativamente cuando se adicionaron al medio concentraciones iniciales mayores de 12,5 g.L-1 (Figura 3). Este resultado coincide con el informado para esta misma bacteria (9).
Este fenómeno de inhibición pudiera explicarse por diversas razones, como es el caso del exceso de sustrato carbonado derivado del empleo de dosis con elevadas concentraciones de este elemento. Aunque es más probable que la presencia de factores antinutricionales en la soya, tales como los inhibidores de tripsina, hemaglutininas y factores antivitamínicos (20), hayan podido influir negativamente en la fisiología del microorganismo.
La constante de afinidad por el sustrato (Ks) y la velocidad máxima de crecimiento (mmax) se calcularon mediante el empleo del modelo de Monod clásico, teniendo en cuenta la zona de concentraciones de extracto acuoso de soya hasta 12,5 g.L-1, donde no existe inhibición del crecimiento. Se obtuvieron valores de Ks = 0,943 g.L-1 y de mmax=0,052 h-1.
Para la zona de inhibición se realizó una modificación, como se presenta en la siguiente ecuación. ]]>
En la Figura 4 se muestran los resultados experimentales y los obtenidos a partir del modelo para la cepa estudiada.
El modelo correlaciona con un valor r2=0,923, los valores experimentales de µ y los obtenidos por el modelo propuesto.
Los parámetros cinéticos calculados permitieron caracterizar la cepa ICA 8001 frente a los sustratos evaluados. El valor de Ks obtenido para la melaza es inferior al que se obtuvo para el extracto acuoso de soya, lo que explica una mayor afinidad de la cepa por el primer sustrato.
En cuanto al fenómeno de inhibición presente en ambos sustratos, se pudo observar que en el caso de la melaza fue más marcado, ya que la caída en los valores de m fue mucho más abrupta que la relacionada con el extracto acuoso de soya (Figuras 1 y 4). El cálculo de la constante de inhibición del sistema (Ki) permitió fundamentar matemáticamente este hecho, pues el valor para la melaza fue superior que el correspondiente al extracto acuoso de soya. Este comportamiento pudo estar relacionado con la presencia de mayores concentraciones de carbohidratos o de otros elementos antinutricionales en la melaza, en comparación con el extracto acuoso de soya.
Los modelos matemáticos propuestos para explicar el comportamiento de la población de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, frente a estos componentes del medio de cultivo, mostraron valores altos de R2, evidenciando la calidad del ajuste de estos a los datos experimentales.
En general, el trabajo realizado aporta conocimientos acerca de la fisiología de Bradyrhizobium, pues evidencia la relación entre la composición del medio de cultivo y los requerimientos nutricionales del microorganismo, así como el diseño de un medio de cultivo puede contribuir a la obtención de inoculantes más efectivos que contengan elevadas concentraciones celulares. ]]>