Efectos de la aplicación de un análogo espirostánico de brasinoesteroides en vitroplantas de banano (Musa spp.) durante la fase de aclimatización
Effects of applying of brassinosteroids analog spirostanic in banano (Musa spp.)vitroplants during acclimatization phase
Ms. C. H. Izquierdo,I Dra. C. Miriam Núñez,I Dra. C. María C. González,II Ruth ProenzaIII
I Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, C.P. 32700
II Investigadora Titular del departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas ]]>
III Especialista de la Biofábrica Habana, carretera a Jamaica. Finca “El Llano” Km. 2 ½ San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, C.P. 32700
RESUMEN
La aclimatización de las plantas provenientes del cultivo in vitro, a las condiciones ex vitro, es de gran importancia para los bananos. El trabajo se desarrolló en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas y en la Biofábrica de San José de las Lajas, con el objetivo de evaluar el efecto que ejerce un análogo de brasinoesteroides (ABr) aplicado durante la fase de aclimatización en algunos caracteres morfoanatómicos, fisiológicos y citogenéticos en las vitroplantas de banano del clon ‘FHIA-18’ cuando las mismas se obtuvieron con el empleo del ABr de forma consecutiva en todas las fase del cultivo in vitro de este genotipo. Se utilizó como sustrato una mezcla de materia orgánica y suelo del tipo Ferralítico Rojo compactado eútrico en una relación 3:1 v/v. A los 45 días, se evaluó el porcentaje de supervivencia, el área foliar, la masa seca total, el contenido de proteínas solubles totales, la densidad y longitud de los estomas, así como el grosor de la cutícula. Como resultado se obtuvo que la inmersión de las raíces de las vitroplantas durante 15 minutos antes de su plantación y la aspersión foliar con el ABr a concentraciones que oscilaron entre 0.02-0.2 ?mol.L-1, 15 días después de la plantación, incrementó la supervivencia de las plantas en un 11 % aproximadamente con respecto a las plantas del tratamiento control; y presentaron mayor área foliar, masa seca, contenido de proteínas y se informó por primera vez que el ABr estimuló el crecimiento en grosor de la cutícula y mantiene constante el número de cromosomas.
Palabras clave: cutícula, cultivo ex vitro, morfología, número de cromosomas, productos bioactivos.
ABSTRACT
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The acclimatization of plants from the culture in vitro to ex vitro conditions is very important for bananas. This study was carried out at the National Institute of Agricultural Sciences and Plant-factory San Jose de las Lajas. The objective was to evaluate the effect of a brassinosteroids analog (ABr) applied during the acclimatization phase in some morpho-anatomics, physiological and cytogenetic characters in the vitroplants of 'FHIA-18' clone, obtained with the use of ABr consecutively in every phase of in vitro culture of this genotype. A mixture of organic matter and eutric compacted Red Ferralitic soil at a rate of 3:1 v/v was used as a substrate. At 45 days, survival percentage, total dry mass, soluble proteins content, stomatal density, stomatal length and the cuticle thickness was evaluated. As a result, vitroplants root immersion for 15 minutes before being planted and foliar spraying with ABr between 0.02-0.2 ?mol.L-1, 15 days after planting, increased plant survival by 11 % approximately compared to the control plants; and they presented bigger foliate area, dry mass and proteins content. It is informed for the first time that ABr stimulates the thickness growth in the cuticle and maintains constant the chromosomes number.
Key words: cuticle, ex vitro cultivation, morphology, chromosome number, bioactive products.
INTRODUCCIÓN
Una vez finalizada la propagación in vitro de las plántulas es imprescindible la adaptación de las mismas a las condiciones ambientales ex vitro no controladas, tanto en casa de cultivo como en condiciones campo; esta fase se conoce como aclimatización. Las plantas deben adaptarse desde el punto de vista morfológico y fisiológico después de su transferencia del cultivo in vitro a las condiciones ex vitro, es decir que cambian su metabolismo heterotrófico o mixotrófico al autótrofo (1, 2).
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El banano (Musa spp.), es uno de los cultivos de mayor consumo. Su producción mundial se estima en más de 245 400 toneladas métricas (3); sin embargo, presenta diferentes problemáticas tales como: las afectaciones por diferentes enfermedades fitopatógenas y el porte alto de las plantas sobre todo en las regiones tropicales y subtropicales, que son desvastadas por los fenómenos climatológicos, como los ciclones (4, 5), entre otras. Aunque la micropropagación contribuye a solucionar algunos de los problemas anteriores, la misma también tiene sus limitantes como son: el bajo coeficiente de multiplicación, alto porcentaje de fenolización de los explantes, los niveles de ploidia cuando los subcultivos son prolongados y una baja supervivencia durante la aclimatización de las plantas, que es la fase final de cualquier protocolo de regeneración de plantas, además de la influencia del genotipo (6, 7).
Los brasinoesteroides son hormonas esteroidales de las plantas esenciales para su normal crecimiento y desarrollo (8, 9). Sin embargo, su respuesta depende de la estructura de la cadena carbonada (en el caso de los análogos), de la especie y de la variedad de planta de que se trate. En la actualidad se emplean los análogos de brasinoesteroides sintetizados en Cuba para mejorar la propagación in vitro y la aclimatización de los cultivos (10), ya que se consideran sustancias antiestrés (10, 11). Por lo que su empleo en todas las fases del cultivo in vitro y su posterior utilización en la fase de aclimatización pudiera resultar beneficioso para mejorar la supervivencia de las plantas.
Se emplean los análogos de brasinoesteroides (ABr), en una u otra fase de la micropropagación de los plátanos y bananos (10, 12); sin embargo, no se ha estudiado hasta el momento el efecto que provocan en la morfogénesis, la fisiología y anatomía de las plantas que se obtienen cuando los mismos se utilizan de forma consecutiva en todos los medios de cultivo en la fase in vitro, así como la influencia de la inmersión de la raíces y la posterior aspersión foliar a las plantas en las condiciones ex vitro y si el ABr induce o no variabilidad genética.
El trabajo se realizó con el objetivo de evaluar el efecto que ejerce un análogo de brasinoesteroides (ABr) aplicado durante la fase de aclimatización en algunos caracteres morfoanatómicos, fisiológicos y citogenéticos en las vitroplantas de banano del clon ‘FHIA-18’ cuando las mismas se obtuvieron con el empleo del ABr de forma consecutiva en todas las fase del cultivo in vitro de este genotipo.
MATERIALES Y MÉTODOS
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El trabajo se realizó en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas y en la Biofábrica de San José de las Lajas, provincia de Mayabeque.
Para la aclimatización se empleó como material vegetal, vitroplantas procedentes de la fase de enraizamiento in vitro del clon ‘FHIA-18’ (AAAB), que es uno de los híbridos que más se cultiva en el país. Las mismas se obtuvieron con la utilización del análogo de brasinoesteroides (ABr) en todas las fases de propagación in vitro (establecimiento, multiplicación y enraizamiento).
La aclimatización se realizó según la metodología establecida (13). Las vitroplantas se plantaron en bandejas de polieturano de 70 alvéolos (cepellones), que contenían un sustrato compuesto por materia orgánica (cachaza) y suelo Ferralítico Rojo compactado éutrico (14), en una proporción 3:1 v/v, al que se le garantizó el riego por nebulización en los primeros 10 días, para lograr una alta humedad relativa (95-100 %). Para el sombreo se utilizó una malla negra (70 % de reducción de luz solar). Las características químicas del sustrato se muestran en la Tabla I.
Se empleó un tratamiento control sin aplicación del ABr y tres tratamientos en los que se realizó la inmersión de las raíces de las vitroplantas en el ABr (masa molar es de 446,606 g.mol-1) y 15 días después de la plantación se asperjaron con el análogo a las concentraciones de 0.02; 0.1 y 0.2 ?mol.L-1; la aspersión se realizó a razón de 2 mL por vitroplanta.
A los 45 días, se evaluó: el porcentaje de supervivencia (35 plantas), el área foliar (20 plantas) la masa seca total (5 plantas) y el contenido de proteínas solubles totales (15).
Para el estudio anatómico se tomó la última hoja completamente extendida (de la base del pseudotallo hacia el ápice) y de la zona central (sin incluir la nervadura) se cortó una porción de 1 cm2 aproximadamente y se les realizaron cortes transversales a mano alzada con una cuchilla de afeitar ASTRA. Todo el procedimiento se realizó según lo informado en la literatura (16, 17).
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La densidad estomática se determinó en cinco plantas, para lo cual se contó la cantidad de estomas por ambas superficies foliares (adaxial y abaxial), el conteo se realizó a través del ocular micrométrico del microscopio que tenía un aumento de 40 x, la longitud de los estomas y el grosor de la cutícula, se midieron de forma similar a la anterior. En todos los casos se realizaron 25 mediciones.
Para el estudio del cariotipo se utilizaron raíces de aproximadamente un centímetro de longitud y se siguió el procedimiento descrito por Román (18). Se realizó el conteo de los cromosomas a cinco plantas por tratamiento y se contaron 25 células por planta al inicio (cero días) y final (45 días) de la aclimatización, para lo cual se empleó un microscopio óptico Olympus con cámara fotográfica Canon acoplada. Las mejores metafases se fotografiaron con un objetivo de 100 x y la lente de la cámara con un ocular de 10 x.
En el experimento se empleó un diseño completamente aleatorizado, se repitió dos veces y se utilizó en cada caso, como dato primario, la media de ambas repeticiones para cada tratamiento experimental. El porcentaje de supervivencia se estudió a través del análisis de las diferencias entre proporciones, para el resto de las variables se realizó un Análisis de Varianza (ANOVA) de clasificación simple para el análisis de los datos y las medias se compararon según la Prueba de Tukey al 95 %. Para el procesamiento de los mismos se utilizó el paquete estadístico STATGRAPHICS Plus versión 5.0 para Windows.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El porcentaje de sobrevivencia es un indicador muy importante en la fase de aclimatización, pues de él depende la cantidad de plantas que pueden llevarse a vivero y posteriormente al campo. La Figura 1 muestra los resultados: como se puede apreciar las plantas del tratamiento 4 [I + A.- ABr (0.2 ?mol.L-1)] alcanzaron los mejores resultados, ya que incrementaron su supervivencia en 11 % (96.65 %) aproximadamente con respecto a las plantas del tratamiento control.
Como se puede apreciar en la tabla anterior el área foliar osciló entre 3.06-3.54 cm2 y los mejores resultados los obtuvieron las plantas del tratamiento cuatro [ABr (0.2 mmol.L-1)], al igual que en el caso de la masa seca y el contenido de proteínas. Otros autores también informan que han alcanzado buenos resultados cuando han evaluado estos y otros parámetros morfológicos, fisiológicos y bioquímicos con la utilización de un análogo de brasinoesteroides en la fase in vitro y la posterior evaluación de su efecto residual en la fase de aclimatización en un clon de plátano macho (23), así mismo también han informado buenos resultados cuando utilizan los brasinoesteroides (24, 25), ya que atenúan el estrés tanto biótico o abiótico.
La utilización de este nuevo regulador del crecimiento (ABr) en todas las fases del cultivo in vitro (establecimiento, multiplicación y enraizamiento) y con posterioridad en la fase ex vitro, sugiere que las plántulas acumularon mayor biomasa durante la fase in vitro, que las condicionó favorablemente para sobrevivir al estrés provocado por el cambio a las condiciones ex vitro, lo que coincide también con lo informado por Aragón y col. (7), que plantean que el éxito de la aclimatización en los plátanos, depende de que las plantas puedan pasar de las condiciones heterotróficas o mixotróficas (mezcla de autotróficas con heterotróficas) al autotrofismo, proceso que está relacionado con las reservas que obtienen las plántulas durante la fase in vitro.
Los resultados que se relacionan con la densidad estomática, longitud de los estomas y grosor de la cutícula se presentan en la Tabla III. Como se puede observar no hubo diferencias significativas en cuanto a la densidad y longitud de los estomas entre las plantas de los diferentes tratamientos, sin embargo si hubo diferencias estadísticas en el grosor de la cutícula entre las plantas de los diferentes tratamientos.
El agua es la sustancia más abundante en los tejidos vegetales. Sin embargo las partes aéreas de las plantas presentan una mala economía de la misma, ya que del total de agua que absorben por la raíz (100%) retienen una pequeña porción, que la emplean fundamentalmente en la fotosíntesis (1-2 %) y pierden en forma de vapor por la transpiración entre el 98-99 % del total (26). La cutícula cubre las células epidérmicas, formando un límite entre la planta y su ambiente exterior; representa una barrera primaria, que minimiza la pérdida de agua y de solutos y, protege la planta contra el estrés biótico y abiótico, pero también puede actuar en varios procesos que se relacionan con la delimitación de órganos, la formación de tricomas y estomas (27). El incremento de la resistencia a Botrytis cinerea (Pers.) en plantas mutantes de Arabidopsis se relacionó con el crecimiento de la cutícula (28, 29).
En estudios de campo en que se utilizaron los híbridos 'FHIA-01', 'FHIA-02' y 'FHIA-03' el grosor de la cutícula por la cara adaxial osciló entre 2,38-2,81 μ m, el grosor de la epidermis adaxial, osciló entre 10,92-12,45 μm (30). Si se considera que el hongo causante de la sigatoka penetra principalmente vía estomática, una baja densidad de los mismos como la presentan los híbridos FHIA, así como un mayor grosor de la cutícula en etapas tempranas del crecimiento de las plantas (fase de aclimatización) podrían considerarse factores de gran importancia y pudieran ser entre otros, los responsables del mayor grado de resistencia a la enfermedad presentado por los mismos. ]]>
La densidad estomática, que es de 1:3 en la relación ADA/ABA y la longitud de los estomas es superior en la cara ABA con respecto a la ADA (31). Las hojas son anfiestomáticas, al igual que las de Ocimum basilicum (18). Estos caracteres están fijados genéticamente en las diferentes especies y por lo general no varían, por lo que es una característica deseable en la propagación de este genotipo de banano con el empleo de ABr.
Con respecto al análisis del cariotipo se mantuvo constante el número de cromosomas 2n = 4x = 44 (tetraploides) (Figura 2).
En Passiflora cincinnata Mast. durante el proceso de embriogénesis somática (32) y en el mantenimiento in vitro de líneas de germoplasma de Scutellaria baicalensis Georgi (Huangqin) (33), mostraron que en todos los casos se mantuvo constante el número de cromosomas. Así mismo, Román (18), no encontró variabilidad en el número de cromosomas al caracterizar genotipos diploides, triploides y tetraploides de plátanos y bananos.
Los resultados de este trabajo muestran que el ABr no provocó cambios en el número de cromosomas de las plantas de banano del clon 'FHIA-18' en la fase de aclimatización mediante la inmersión de las raíces y la posterior aspersión foliar a las plantas; y el mismo pudo contribuir a mejorar los procesos de transporte y absorción de nutrientes por la planta, por lo que esta sustancia además de ejercer un efecto positivo en el crecimiento y desarrollo, interviene en el engrosamiento de la cutícula sin cambios en el número de cromosomas.
La importancia de estos resultados consiste en que facilitan los estudios del número cromosómico en el género Musa, aspecto de gran significación para su caracterización y como método para evaluar el comportamiento de la estabilidad y variabilidad genética en cuanto al número cromosómico en plantas de esta especie regeneradas por vías tradicionales y biotecnológicas cuando se utiliza un nuevo regulador del crecimiento vegetal como el análogo de brasinoesteroides.
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Recibido 26/09/2010, aceptado 17/02/2012
Ms. C. H. Izquierdo, Investigador Auxiliar del departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, C.P. 32700. Email: hioviedo@inca.edu.cu
