Modificación en el método de tinción de las polifenoloxidasas y anhidrasas carbónica en las plantas

Modification of the staining method of polyphenoloxidases and carbonic anhydrases in plants

M.Sc. Regla M. Lara Rodríguez, Dra.C. Marilyn Florido Bacallaol, Dr.C. Mario Varela Nualles

Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba, CP 32700.

RESUMEN

Las isoenzimas han probado ser de gran valor en estudios de diversidad genética de diferentes especies. Por tal motivo se realizó el presente trabajo, con el objetivo de describir una modificación eficiente en la tinción histoquímica de las isoenzimas polifenoloxidasas y anhidrasas carbónica en plantas, la cual consiste en sustituir por agua destilada los tampones de tinción utilizados para revelar estas isoenzimas. La efectividad de estas adaptaciones propuestas se corroboró utilizando la prueba “t” de Student para datos relacionados y realizando estos análisis en diferentes cultivos. Los perfiles electroforéticos observados en las tinciones mostraron igual patrón de bandas y no existieron diferencias significativas entre los tratamientos, lo que demuestra que es posible sustituir los tampones de tinción tradicionalmente empleados en estas técnicas por agua destilada. La alta repetibilidad de estas tinciones permitirá en lo sucesivo emplear las modificaciones propuestas en el revelado de estas isoenzimas.

Palabras clave: marcadores bioquímicos, polimorfismo, tinción histoquímica.

ABSTRACT

Isozymes have proved to be valuable in genetic diversity studies of different species. Therefore, this study was aimed to describe an efficient histochemical staining modification of carbonic anhydrase and polyphenol oxidase isozymes in plants, which consists of replacing the staining buffers used to develop these isozymes by distilled water. The effectiveness of these proposed adjustments was confirmed when using the “t” test of Student for related data and conducting these tests in different crops. The electrophoretic profiles observed in stainings showed the same pattern of bands without significant differences among treatments, demonstrating that it is possible to replace traditionally used staining buffers in these techniques by distilled water. The high repeatability of such stainings will enable to employ the proposed modifications to develop these isozymes.

Key words: biochemical markers, polymorphism, histochemical staining.

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el desarrollo del presente trabajo se tomaron muestras de 1 g de tejido foliar fresco de diez plántulas de tomate, que se homogeneizaron en frío, con un tampón de extracción que contenía sacarosa 20 % (m/v) y 0,02 % de ditriotreitol, empleando una relación masa/volumen de 1/2. El extracto se centrifugó a ]]> 14 000 rpm a 0 °C durante cinco minutos.

El sobrenadante obtenido se sometió a electroforesis sobre gel de poliacrilamida al 8,5 % en una cámara de electroforesis vertical Mighty Small II de Pharmacia Biotech y se siguió el protocolo descrito por Laemli (15). El tiempo de corrida en cada caso estuvo determinado por el desplazamiento de la banda de Kolrhauch hasta aproximadamente 6 cm del inicio. Se utilizó una intensidad de corriente constante de 15 mA hasta que la banda migró al gel separador, donde se incrementó la intensidad de corriente a 25 mA.

Se realizaron las tinciones histoquímicas para las enzimas PPO y AC de acuerdo a los métodos descritos por Wendel y Weeden (16) y González^A respectivamente; luego se incubaron en ácido acético al 5 % (v/v).

Los patrones de banda de cada accesión se visualizaron bajo luz blanca atendiendo al número y la posición de cada banda. Se realizaron tres repeticiones en cada sistema electroforético analizado.

Los patrones enzimáticos obtenidos en la tinción con los tampones Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2 y Tris–HCl 0,5 M, pH 7,19 para los sistemas PPO y AC, respectivamente, se utilizaron como testigos en el análisis de los resultados (T1). Se emplearon diferentes tratamientos que sustituyen estos tampones por agua destilada con valores de pH entre 6,63 y 6,89, y conductividad iónica por debajo de los 3 µScm^-1, los que se exponen en la Tabla I.
]]> A partir de los valores promedio de la posición relativa de las bandas (Rf) presentes en los zimogramas de cada uno de los tratamientos, se realizó la prueba “t” de Student para datos relacionados, utilizando el paquete estadístico SPSS 11,5 sobre Windows.

Se realizaron además estos análisis electroforéticos en hojas jóvenes de papa (Solanum tuberosum L.) y fresa (Fragaria ananassa Duch) para corroborar la efectividad de las tinciones propuestas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las múltiples formas de actividad PPO y AC encontradas confirman la presencia de estas isoenzimas en tejido foliar de plántulas de tomate. Estos sistemas isoenzimáticos no presentaron alteraciones en los patrones de bandas, cuando el tejido se reveló con los tampones tradicionales Tris-HCl 0,1 M, pH 7,2 y Tris-HCl 0,5 M, pH 7,19 para PPO y AC, respectivamente, ya que se pudo observar que las 10 plántulas de tomate evaluadas mostraron igual cantidad y posición relativa de bandas, independientemente del tampón o procedencia del agua empleada (Figura).

Estos resultados se corresponden con lo planteado por otros autores, quienes señalan que valores de pH entre 6 y 8 son los de mayor estabilidad de la enzima AC (17).

De igual forma, se han realizado investigaciones en PPO para determinar el pH de mayor estabilidad en pera (Pyrus communis L. Reino) y manzana (Pyrus malus L.), informándose que esta enzima fue más estable a pH 6,5 y entre 6,5 y 7,5, respectivamente (18). ]]>
Al utilizar estos procedimientos de tinción para papa y fresa, se encontraron variaciones interespecíficas, ya que se observaron diferencias en las movilidades electroforéticas en los diferentes cultivos, siendo estas mayores entre papa y fresa para AC y entre tomate y papa en PPO. Es de señalar la presencia de tres y cuatro bandas comunes en los dos cultivos del género Solanum. Sin embargo, igualmente se obtuvieron patrones de banda idénticos en ambos sistemas isoenzimáticos utilizando agua destilada (T2, T3, T4 y T5) y los sistemas de tampones tradicionales (T1) (Figura, Tabla II).

Los resultados demostraron que es posible sustituir los tampones de tinción tradicionalmente empleados en estas técnicas por agua destilada. La alta repetitividad de estas tinciones permitirá en lo sucesivo emplear las modificaciones propuestas en el revelado de estas isoenzimas, lo que contribuirá a disminuir los costos de estas técnicas por concepto de reactivos.

Cabe destacar la utilidad de estos sistemas enzimáticos, ampliamente distribuidos en el reino vegetal en estudios genéticos y fisiológicos en plantas. Al respecto, se ha postulado la participación de PPO en mecanismos de defensa frente a patógenos, transporte de electrones y oxidación de auxinas. La enzima ofrece resistencia a infecciones por patógenos (virus, bacterias, hongos, herbívoros) o por daño mecánico. Asimismo, se ha indicado que las PPO están involucradas en la formación y el desarrollo de raíces, en la formación de ligninas y en procesos biosintéticos en plantas, como la biosíntesis de betalaínas y de compuestos fenólicos de plantas, particularmente fenilpropanoides (19, 20, 21).

Igualmente, se señala que la AC tipo ß, que es la que se encuentra en plantas, ayuda a elevar la concentración de CO₂ dentro del cloroplasto, para incrementar la tasa de carboxilación de la enzima Rubisco. Esta es la reacción que integra el CO₂ en carbohidratos durante la fotosíntesis, siendo muy utilizada en estudios de resistencia y tolerancia a estreses bióticos y abióticos (22, 23, 24).

Nota al pie

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Recibido: 5 de diciembre de 2014
Aceptado: 24 de junio de 2015

M.Sc. Regla M. Lara Rodríguez, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, provincia Mayabeque, Cuba, CP 32700. Email: mlara@inca.edu.cu