Signals produced by Rhizobium leguminosarum in the interaction with common bean (Phaseolus vulgaris L.)
Dra.C. María C. Nápoles GarcíaI, Dr.C. Juan C. Cabrera PinoII, Rob OnderwaterII, Ruddy WattiezIII, Ionel Hernández ForteI, Lisbel Martínez GonzálezI, Dra.C. Miriam Núñez VázquezI
IInstituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, CP 32700.
IIUnité Biotechnologie-Materia Nova A.S.B.L., Rue des Foudriers, 1, 7822 Ghislenghien, Belgium.
IIIInstitute Biosciences, University of Mons, Belgium.
La interacción Rhizobium-leguminosas depende de un complejo intercambio de señales, que se mantiene durante todo el proceso simbiótico y de las que solamente una combinación correcta permitirá una simbiosis eficiente. Estas plantas secretan flavonoides, reconocidos por bacterias compatibles y que inducen sus genes nod. Estos codifican las proteínas que sintetizan y exportan lipoquitooligosacáridos conocidos como factores Nod. Los factores Nod activan los procesos de infección e inician la división celular en la raíz, hasta la formación del nódulo y participan también en la fijación biológica del nitrógeno. Existen evidencias de que el uso de inductores de los genes nod incrementa la nodulación en algunas leguminosas. El objetivo de este trabajo fue estudiar la producción de algunas moléculas señales, inducidas por la isoflavona genisteína en una cepa de R. leguminosarum y evaluar el impacto de esa inducción en el efecto del inóculo sobre plantas de frijol común. La fracción lipídica en los inóculos fue extraída con n-butanol y analizada por cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alta resolución y cromatografía gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas. En los inóculos inducidos con genisteína se detectó una cantidad superior de lipooligosacáridos (factores de nodulación) y de ácidos grasos de alto peso molecular, con diferencias significativas respecto a los controles sin inducir. En relación con ese enriquecimiento en moléculas señales, los inóculos inducidos con genisteína, mostraron un efecto positivo en las plantas de frijol de la variedad Cubacueto 25-9, con mayor número de nódulos y contenido de clorofila que las plantas no inoculadas (control).
Palabras clave: factores Nod, nodulación, simbiosis, leguminosa.
ABSTRACT
Legume-Rhizobium interaction depends on a complex signal exchange that continues throughout the entire symbiotic process, out of which just the correct combination will give rise to an efficient symbiosis. These plants secrete flavonoids that are recognized by compatible bacteria inducing their nod genes, which encode proteins that synthesize and export lipochitooligosaccharides called Nod factors. These factors activate infection process and initiate cell division in the root until making up the nodule and also participate in nitrogen biological fixation. There is evidence that the use of nod gene inducers increases some legume nodulation. The objective of this work was to study the production of some signal molecules induced by genistein isoflavon in a R. leguminosarum strain as well as to evaluate induction impact on inoculum effect upon common bean plants. Inoculum lipid fraction was isolated with n-butanol and analyzed by thin layer chromatography, high performance liquid chromatography and gas chromatography coupled to a mass spectrometer. Regarding the inocula induced with genistein, a higher amount of lipooligosaccharides (Nod factors) and high-molecular-weight fatty acids were detected, showing significant differences with non-induced controls. Concerning such signal molecule enrichment, genistein-induced inocula had a positive effect on “Cubacueto 25-9” bean plants, with a higher amount of nodules and chlorophyll content than non-inoculated plants (control).
Key words: Nod factors, nodulation, symbiosis, legumes.
INTRODUCCIÓN
Dentro del grupo de las leguminosas que poseen semillas comestibles, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) corresponde a una de las más importantes. La domesticación de este cultivo ocurrió varios miles de años atrás en Mesoamérica y en la región andina (1). Actualmente su cultivo se encuentra distribuido en los cinco continentes y representa la legumbre más importante en la dieta humana, al proporcionar proteínas y carbohidratos a más de 300 millones de personas, especialmente en América Latina, el Caribe y ÁfricaA. Como leguminosa, P. vulgaris, se puede asociar a bacterias del suelo que fijan nitrógeno, lo cual le permite crecer en condiciones de bajo contenido de Nitrógeno (N) (2, 3).
Durante los últimos años, diversas investigaciones han permitido conocer y entender la comunicación a nivel molecular que rige la simbiosis rizobios-leguminosas (4, 5). Los factores Nod o lipoquitooligosacáridos han sido las moléculas mejor estudiadas entre esas señales, con un papel esencial en la formación de los nódulos y su funcionamiento (6, 7). Otros autores han demostrado que estas moléculas pueden jugar un papel en la germinación, fotosíntesis, crecimiento y rendimiento de diversos cultivos, así como ante condiciones de estrés biótico y abiótico (8, 9).
Se han hecho grandes esfuerzos para mejorar esta relación, dado que esta simbiosis es, en gran medida, responsable de aportar el nitrógeno requerido en la agricultura mundial. Esta contribución ha estado enfocada en optimizar el estado fisiológico de las bacterias, para generar la producción de señales determinantes en la simbiosis, por lo que el objetivo de este trabajo fue estudiar la producción de algunas moléculas señales, inducidas por el isoflavonoide genisteína en una cepa de R. leguminosarum y evaluar el impacto de esa inducción en el efecto del inóculo sobre plantas de frijol común.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivo bacteriano. Extracción de fracción lipídica
Se utilizó la cepa R. leguminosarum CF1, conocida por su simbiosis con el frijol y procedente del Instituto de Suelos, Ministerio de la Agricultura, La Habana, Cuba. A partir de ella se produjo un preinóculo en 50 mL de medio Extracto de Levadura Manitol (10), a pH 6,8; con el cual se inocularon 600 mL del mismo medio y otros 600 mL de este, al cual se le adicionó genisteína (Sigma) a una concentración final de 5 µM (5 micromoles de genisteína por litro de medio). Los inóculos se obtuvieron después de mantener los frascos a 150 r.p.m. durante 48 horas, en un agitador orbital, a 28 ± 2 ºC de temperatura.
Para cada caso se repitió tres veces el procedimiento, con lo cual se contó con tres muestras de cada tratamiento (sin inducir e inducido con genisteína).
Teniendo en cuenta que la mayoría de las señales reconocidas por su actividad biológica en la interacción Rhizobium-leguminosas son de naturaleza lipídica, se realizó una extracción selectiva de estas moléculas del inóculo, tratado con la genisteína (inducido) o no (control), utilizando un solvente de alta especificidad para este tipo de componentes. Para ello se utilizaron 180 mL de n-butanol en cada muestra. Se agitaron en zaranda orbital a 150 r.p.m. durante 15 minutos y se mantuvieron toda la noche en reposo y oscuridad a temperatura ambiente de 25 ± 2 ºC. Se extrajo la fase orgánica en cada muestra, se centrifugaron 12000 g, 10 ºC, 10 min. Todas las muestras se concentraron por rotoevaporación a 50-80 ºC hasta obtener 2 mL de cada una de ellas, estas se utilizaron para la detección de señales producidas por la bacteria.
Detección de señales
Análisis por cromatografía de capa fina (TLC, del inglés Thin Layer Chromatography)
Los componentes de la mezcla fueros separados por TLC, utilizando placas de gel de sílice (MERCK 60. GF-254). Se empleó n-propanol: agua: amonio concentrado 7:2:1, v:v:v, como solvente. Las manchas fueron visualizadas, utilizando un revelador a base de ácido sulfúrico en metanol.
Análisis por cromatografía líquida de alta resolución, fase inversa (HPLC-C18, del inglés High Performance Liquid Chromatography)
Con el objetivo de evaluar la presencia de factores de nodulación entre los metabolitos, 10 µL de todas las muestras fueron analizadas por HPLC, utilizando una columna de fase inversa Waters Symmetry C-18 (46 x 250 mm) de 5 µ de tamaño de partículas, instalada en un sistema HPLC Waters Alliance. La velocidad del flujo fue de 1 mL min-1 y como solventes se utilizaron agua (A) y acetonitrilo (B) con un gradiente: 0-10 min 18 % B, 10-30 min 60 % B, 30-35 min 95 % B, 35-45 min 18 % B. Se utilizó un detector espectrofotométrico UV-Waters a una longitud de onda de 214 nm.
Análisis por cromatografía gaseosa acoplada a un espectrómetro de masas (GC-MS, del inglés Gas Chromatography - Mass Spectrometry)
Los derivados volátiles de los ácidos grasos fueron preparados por sililación, utilizando como reactivo el BSTFA (N, O-Bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida) en combinación con trimetil clorosilano (TMCS) (Kit BSTFA+TMCS, Supelco). Para el análisis por GC-MS se utilizó un cromatógrafo de gases, acoplado a un espectrómetro de masas marca Shimadzu GC-MS QP-2010; sistema equipado con autoinyector AOC-20i, automuestreador AOC-20s y un sistema de inserción directa, controlado por el software “GC-MS solution”. Se empleó una columna Optima 5 MS (30 m × 0,25 mm DI, 0,25 µm espesor de película). Las condiciones de los análisis cromatográficos fueron la temperatura del inyector 310 °C; la temperatura del horno 100 °C durante seis minutos. Posteriormente se incrementó a 320 °C a razón de 20 °C min-1, manteniéndose durante cinco minutos. El volumen de inyección fue de 1 µL y el flujo en la columna de 0,75 mL min-1, usando helio como gas de arrastre.
Efecto sobre la nodulación y el crecimiento de plantas
Se utilizó la variedad de frijol Cubacueto 25-9. Las semillas fueron inoculadas con 0,5 mL de una suspensión de bacterias de 5,4 x 108 UFC mL-1 y sembradas sobre un suelo Ferralítico Rojo Lixiviado típico, éutrico (11). Las plantas se mantuvieron en condiciones de cámara de crecimiento con fotoperiodo de 12 horas luz, a 24 ± 2 °C y se regaron cada día con agua corriente. Transcurridos 35 días se determinó el número de nódulos totales, la masa seca aérea (posterior secado a 65 °C durante cinco días) y el contenido de clorofila mediante SPAD. Como tratamientos se emplearon un control sin inocular y un tratamiento inoculado con el biopreparado inducido.
Los datos fueron procesados por análisis de varianza simple. Se utilizó el test de comparación de medias de Tukey para α<0,05, con el objetivo de discriminar diferencias entre las medias. Todos los gráficos fueron realizados en el programa Microsoft Excel 2010.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Detección de señales
El perfil de separación por TLC sobre un soporte de gel de sílice (fase normal) de cada una de las réplicas de los tratamientos control e inducidos, se representa en la Figura 1.
]]> Si bien este método es relativamente poco específico para el análisis y la separación de mezclas complejas, constituye una herramienta útil para estimar de una manera rápida la complejidad de las muestras e identificar diferencias en su composición (12), algo que se evidencia en el mayor número de manchas obtenidas para los tratamientos inducidos, respecto al control.Al analizar el efecto de ambos tratamientos sobre las plantas de frijol común (tabla), se pudo observar un efecto superior del tratamiento inoculado con el biopreparado inducido sobre el número de nódulos formados con respecto al control. La masa seca aérea no mostró diferencias significativas entre ambos tratamientos; sin embargo, el contenido de clorofilas evidenció el efecto positivo de la inoculación.
Es importante resaltar el hecho de que las plantas control también nodularon. Ello se debe a que se utilizó un suelo sin esterilizar, por lo que es muy posible que en el residieran poblaciones de rizobios afines a esta leguminosa, capaces de establecer una interacción simbiótica eficiente. Esto justifica, además de que formaran nódulos en abundante cantidad, que tuviesen un efecto positivo sobre la masa seca de las plantas. No obstante, la presencia de mayor cantidad y diversidad de señales en el inoculante inducido (Figuras 1, 2 y 3) le confirió una calidad superior a este tratamiento, destacándose en el número de nódulos formados sobre las plantas y en el contenido de clorofila. Este indicador constituye una medida indirecta de la fijación del nitrógeno, llevada a cabo en dichas estructuras radiculares. Se plantea que la percepción de factores Nod activa las vías biosintéticas requeridas para la nodulación y la vía involucrada en el flujo de calcio, importantes para la eficiencia en la infección (21).
Los mayores valores de nodulación, unido al incremento en clorofilas, relacionado con el contenido de N, indican que la inducción tuvo un efecto positivo sobre la fijación de nitrógeno. El frijol común produce y trasloca N en forma de ureidos, alantoína y alantoato (22, 23). Los ureidos son considerados más favorables energéticamente para transportar el N desde los nódulos hasta las hojas (24). Se ha demostrado que sólo requieren la mitad de ATP necesaria para producir amidas en su síntesis y menos carbono, lo que le confiere ventajas a estas leguminosas ureídicas sobre las amídicasB.
Otros resultados muestran que el empleo de inoculantes inducidos en la producción de factores de nodulación en la cepa B. elkanii ICA 8001, actúa indirectamente sobre el catabolismo de los ureidos en plantas de soya (25).
La importancia de los factores Nod en la interacción con las leguminosas, no sólo está relacionada con la nodulación y la eficiencia en la fijación biológica del N en condiciones normales y de estrés abiótico. La similitud de su estructura con los quitooligosacáridos, derivados de la pared celular fúngica y activadores de defensa (26), así como evidencias directas sobre la reducción de enfermedades (27) e indirectas sobre la activación de enzimas de defensa (28), suponen una participación de estas moléculas en determinadas respuestas de inmunidad a la invasión por patógenos.
Comparado con otras leguminosas, el frijol común no es de las plantas que puede fijar con mayor eficiencia el nitrógeno (29); sin embargo, existen algunas variedades de P. vulgaris y cepas de rizobios afines, que exhiben altos rangos de fijación (30). En la actualidad nuevas investigaciones intentan mejorar la FBN en frijol, las que incluyen desde el empleo de cepas más competitivas y eficientes, la búsqueda de variedades (31, 32), hasta el desarrollo de inoculantes y formulaciones más complejas. En este estudio se ha optado por inducir en el inoculante la síntesis y la excreción de metabolitos de especial interés y función en esta interacción.
Resulta interesante, en estudios futuros, comparar además, el efecto del inóculo inducido y el inóculo sin inducir, sobre las plantas de frijol. No obstante, resultados de otros ensayos con frijol y en el cultivo de la soya, reiteran resultados positivos al emplear los inoculantes inducidos sobre inóculos sin inducir y sobre el testigo sin inocular (9, 33).
CONCLUSIONES
Notas al pie
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Recibido: 1 de octubre de 2014
Aceptado: 7 de agosto de 2015
Dra.C. María C. Nápoles García, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba, CP 32700.Email: tere@inca.edu.cu
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