Mycorrhization of micropropagated apple rootstocks

Dra.C. Alicia Castillo Sallé,^I Dra.C. Adriana Montañez Massa,^II Dr.C. Roberto Docampo Romero,^III Pablo Rodríguez Bruno,^IV M.Cs. Danilo Cabrera Bologna,^IV Dr.C. Roberto Zoppolo Goldschmidt^IV

^IUnidad de Biotecnología INIA “Las Brujas” Ruta 48, km 10, Canelones Uruguay.
^IILaboratorio de Microbiología de Suelos, Instituto de Ecología y Ciencias Ambientales (IECA) Facultad de Ciencias. Mataojo 2055.
^IIISuelos y Riego, INIA “Las Brujas” Ruta 48, km 10 Canelones Uruguay.
^IVPrograma de Investigación en Producción Frutícola, INIA “Las Brujas” Ruta 48, km 10, Canelones. Uruguay.

RESUMEN

La micropropagación mediante cultivo in vitro de plantas permite la producción a gran escala de individuos genéticamente idénticos al material de partida. Las especies leñosas tienen dificultades en la etapa de aclimatación por la lentitud que presentan en el desarrollo de respuestas fisiológicas y morfológicas a los cambios de ambiente. El éxito final de la propagación in vitro depende de la capacidad de transferencia de las plantas desde el laboratorio a las condiciones de invernáculo. Una de las herramientas para contrarrestar las pérdidas durante la aclimatación, es la utilización de hongos micorrízicos arbusculares (HMA), que establecen asociaciones simbióticas mutualistas no específicas con el 90 % de las plantas vasculares. Los HMA, por su acción como agentes de biorregulación del crecimiento, biofertilizantes o biocontrol, han tenido especial atención en el manejo y propagación de las plantas frutícolas. En este trabajo se presentan los efectos de la inoculación con HMA en el inicio de la aclimatación. Para la micorrización se empleó un solo tipo de inóculo de HMA sobre dos portainjertos de manzano: un clon de M9 y otro de la serie Cornell-Geneva (RN29 y Geneva^®41, respectivamente) en tres sustratos diferentes. Los plantines inoculados con micorrizas presentaron mayor expansión de sus hojas, mayor diámetro y mayor altura, respecto al control, mostrando diferencias significativas. La aclimatación se redujo de 60 a 40 días. La incorporación de este tipo de tecnología, podría generar beneficios orientados a un manejo sustentable de la producción de plantas con menor uso de agroquímicos.

Palabras clave: adaptación, propagación vegetativa, simbiosis.

ABSTRACT

Micropropagation through in vitro plant cultivation allows large-scale production of identical individuals genetically to the starting material. Woody species have difficulties in the acclimatization stage due to their slowness in the development of physiological response to environmental changes. The ultimate success of in vitro propagation depends on the capacity of plants to adapt in the moment of transfering from the laboratory to the greenhouse conditions. One of the tools to offset losses during acclimatization is the use of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF), which sets mutualistic symbiotic associations unspecific with 90 % of vascular plants. AMF, because of their action as agents of growth bioregulation as bio-fertilizers or biocontrollers have received special attention in handling and propagation of fruit plants. In this work the effects of inoculation with AMF at the start of acclimatization are presented to mycorrhization. Inoculation with one type of AMF over two rootstocks of apple was done in a clone of M9 and one rootstock of the Cornell-Geneva series (RN29 and Geneva^®41 respectively) set in three different substrates. Seedlings inoculated with AMF when compared to the control, presented further expansion of their leaves, bigger diameter and greater height, all significantly different. Acclimatization period was reduced from 60 to 40 days. The incorporation of this type of technologies could generate a more sustainable management of plant production with less use of agrochemicals.

Key words: adaptation, vegetative propagation, simbiosis.

Uruguay produce fruta de alta calidad que se destina al mercado interno y a la exportación en volumen variable todos los años, representando alrededor del 5 % del valor bruto de producción anual (VBPA)^A. Para competir en mercados de exportación con alto nivel de exigencia, es necesario alcanzar una alta eficiencia en todas las fases del proceso de producción. Por esta razón, es fundamental instalar montes con plantas de excelente calidad desde el vivero, ya que la planta es el primer eslabón en la cadena de producción de frutas (1).

La fruticultura moderna se basa en plantaciones que utilizan portainjertos clonales enanizantes, que permiten realizar cultivos en alta densidad. A partir del uso de este tipo de portainjertos, se busca un aumento en la eficiencia de la producción, incrementando los volúmenes y uniformizando la calidad de la fruta, así como ofreciendo resistencia a ciertas plagas y enfermedades del suelo (2). Estos portainjertos se propagan vegetativamente en el campo, mediante el empleo de encepadas (acodo en cepada) y para ello es necesario contar con bloques de plantas madres que suministren volúmenes importantes de plantines enraizados.

Las plantas madres de la encepada deben ser controladas anualmente, para conocer y asegurar que se mantiene el estado sanitario libre de patógenos y enfermedades. La micropropagación es otra forma de obtener plantas clonales de alta calidad (3). Con la aplicación de esta técnica es posible la obtención de un gran número de plantas en pocos meses, conservando la sanidad y la identidad genética del material (4).

La micropropagación consiste en producir plantas a partir de porciones de la planta madre, en general se utilizan ápices meristemáticos vegetativos, cultivados asépticamente en un tubo de ensayo, donde se puedan controlar estrictamente las condiciones del ambiente y la nutrición a través del medio de cultivo (5). Esta técnica, que se ha convertido en una alternativa importante dentro de los métodos de propagación en una amplia gama de especies (6), se compone de una serie de etapas secuenciales: establecimiento, proliferación o multiplicación, enraizamiento y aclimatación (7). Sin embargo, se presentan algunas dificultades ya que una planta que se ha originado in vitro difiere en muchos aspectos de las que se forman in vivo (8), debido a que las condiciones, tanto ambientales como del sustrato en que crecen, son muy diferentes. Asimismo, es importante señalar que el crecimiento de las plantas in vitro es heterótrofo en tanto in vivo es autótrofo.

La aclimatación resulta ser el cuello de botella de todo el proceso de micropropagación, debido a la baja sobrevivencia de plantines que se da en el pasaje del crecimiento in vitro al crecimiento in vivo. El éxito final de la propagación in vitro depende de la capacidad de transferencia de las plantas, desde el ambiente del laboratorio a las condiciones de invernáculo. ]]>
El ambiente in vitro, con una alta humedad relativa, bajo o nulo intercambio gaseoso, escasez de CO₂ durante casi todo el período, producción de etileno y baja densidad fotosintética, induce cambios morfológicos y fisiológicos en las plantas desarrolladas bajo esa condición. La anatomía de la hoja in vitro es influenciada por la luz y la humedad, diferenciándose anatómicamente de las originadas in vivo (8, 9). Después de transferir las plantas al ambiente ex vitro, estas tienen que corregir todas esas anormalidades para aclimatarse al nuevo ambiente del invernáculo.

Para aumentar la eficiencia de la aclimatación, se evaluó la aplicación de hongos micorrízicos arbusculares (HMA), como forma de conferir mayor resistencia a los factores de estrés ambiental y en su establecimiento en el campo (10). Varios autores han utilizado la inoculación con micorrizas o bacterias promotoras del crecimiento vegetal, como una herramienta para contrarrestar las pérdidas durante la aclimatación (11, 12). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la inoculación con HMA en plantas micropropagadas de portainjerto de manzano en la fase de aclimatación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Como material vegetal se seleccionaron dos portainjertos de manzano: un clon del M9, denominado RN29, de origen belga y un portainjerto de la serie Cornell-Geneva, el Geneva^® 41, proveniente de la Universidad de Cornell. Ambos portainjertos se multiplicaron y enraizaron in vitro. Las plantas enraizadas se sacaron de los frascos y se lavaron cuidadosamente para remover los restos del medio de cultivo. Al momento del trasplante, los plantines se inocularon con micorriza HMA Glomus mossae monoespórico, obtenido por multiplicación en cultivos trampa de Paspalum dilatatum.

Se colocó 1 g de inóculo en el sustrato, debajo de la planta, al momento del trasplante. Todos los sustratos utilizados fueron autoclavados antes de su uso, 1) compost de cama de caballo; 2) mezcla de ¼ de turba comercial, ¼ de arena, ¼ cáscara de arroz y ¼ de mantillo de pino; 3) turba comercial. El contenido de P del sustrato fue 1,9 , 15,6 y 49,6 mg L^-1, respectivamente (análisis de extracto de pasta saturada por colorimetría) (13). En los tres casos se evaluó cada sustrato en dos condiciones: con micorriza y sin inoculación, como tratamiento control (seis tratamientos). Se evaluaron 150 plantas por tratamiento, en cada recipiente de aclimatación se utilizaron 20 plantas, repitiéndose el ensayo dos veces. Se tomaron muestras de raíces para determinar la presencia de las micorrizas a los 20 días del trasplante. Las raíces fueron teñidas con azul de tripano a razón de 0,5 g L^-1 en solución 1:1 de ácido láctico:glycerol con modificaciones (14).
]]> A nivel vegetativo se midieron los parámetros de crecimiento: altura de la planta, número de hojas y diámetro del cuello en distintas etapas de la aclimatación. Para evitar la deshidratación se cubrieron las plantas durante los primeros 15 días, luego se fue aumentando paulatinamente la ventilación hasta dejarlas sin cobertura. En esta etapa no se aplicaron fungicidas ni fertilizantes.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En los tratamientos inoculados con HMA se observaron las primeras estructuras en el establecimiento de la simbiosis en las muestras tomadas a los 20 días del trasplante; como muestra la Figura 1, dentro de las células del tejido radicular se observaron apresorios.

La Figura 2 muestra los resultados de la evaluación de los parámetros de crecimiento vegetativo en los seis tratamientos, mostrando en ambos portainjertos el mismo comportamiento. Las plantas inoculadas mostraron diferencia significativa en altura, alcanzando la mayor altura en el sustrato de compost de cama de caballo (T1inoc) y en el sustrato mezcla de turba, arena, cáscara de arroz y mantillo (T2inoc). Entre estos dos tratamientos inoculados con HMA no hubo diferencia significativa. En las plantas trasplantadas en turba comercial se obtuvo la menor altura de las plantas y no hubo diferencia significativa entre las inoculadas y las sin inocular (tratamiento T3inoc y T3).

En el número de hojas se observó diferencia significativa entre los tratamientos 1A (inoculado), con un valor promedio de nueve y el tratamiento 2B (sustrato mezcla sin inocular), con siete hojas en promedio. El resto de los tratamientos mostraron un valor intermedio. Si bien el área foliar no se midió, a simple vista era posible observar una mayor expansión de las hojas en los tratamientos con plantas inoculadas.
]]> A los 40 días de la aclimatación se realizó una segunda evaluación al microscopio de las células de la raíz. Se observó el desarrollo de estructuras denominadas arbúsculos, que corresponden al micelio de la micorriza en todos los tratamientos con inoculación (Figura 3).

Las HMA se encuentran asociadas a la mayoría de las especies vegetales en condiciones naturales (15), colonizan las raíces y desarrollan una red o cordones de hifas externas que se extienden a partir de las mismas, de esa forma aumentan la superficie de contacto entre la planta y el suelo. Este micelio externo actúa como un sistema radical complementario, de extraordinaria importancia para la absorción de nutrientes y agua por las plantas (16).

Estos microorganismos benéficos han sido ampliamente estudiados y empleados; sin embargo, su aplicación en plantas micropropagadas es escasa. Los resultados muestran la colonización por parte de la micorriza en etapas tempranas de la inoculación del sistema radicular a los 20 días de la aclimatación y las consecuencias de la simbiosis fueron evidentes en los parámetros de crecimiento evaluados.

En diversos grados, todas las plantas cultivadas in vitro son susceptibles a la crisis o estrés del trasplante, fase que resulta el cuello de botella de todo el proceso de la micropropagación. El éxito final de la propagación in vitro depende de la capacidad de transferencia de las plantas fuera del ambiente del laboratorio a las condiciones de invernáculo, lo cual varía entre las distintas especies; las herbáceas tienen rápida respuesta, en tanto las especies leñosas requieren mayor tiempo para su aclimatación. El conocimiento de las características fisiológicas y morfológicas de las plantas que crecen in vitro es fundamental para minimizar las pérdidas y asegurar una alta sobrevivencia en el trasplante. Al llevar a cabo la inoculación se facilitó el inicio de los cambios fisiológicos que requieren, con el fin de favorecer la adaptación de las plántulas a la autotrofia y posterior crecimiento ex vitro (17).

Tanto la nutrición heterotrófica que se da in vitro, como el escaso mecanismo para controlar la pérdida de agua por poca funcionalidad estomática, hacen que la planta micropropagada esté desbalanceada en su capacidad de absorción y reposición del agua transpirada (18). Debido a la falta de cera en la cutícula respecto de las plantas que crecen en invernáculo o a campo, la tasa de transpiración de estas es significativamente más alta cuando están creciendo in vitro.
]]> En los primeros 25 días del proceso de aclimatación no se observan cambios a nivel morfológico, pues ocurre una transición lenta de procesos fisiológicos ante los cambios en las condiciones ambientales. Sin embargo, en las plantas inoculadas se observó crecimiento y desarrollo de nuevas hojas en etapas tempranas. En esta asociación simbiótica el hongo se nutre de los carbohidratos almacenados en las células vegetales en formas sencillas de fructosa, glucosa y sacarosa, así como de los exudados radicales de las plantas. Es por esta razón, que la inoculación de plantas micropropagadas en etapas tempranas confiere mayor resistencia a los factores de estrés ambiental en la fase de aclimatación (19).

El fósforo es el principal nutriente, con el que se tienen efectos positivos por la asociación de las plantas con HMA ya que es relativamente inmóvil en el suelo, pero también hay beneficios en la dinámica de otros nutrientes como el N, Zn, Mg y Ca (20). En la elección de los sustratos a evaluar se consideró la sensibilidad de las micorrizas a los niveles de fósforo, se seleccionaron dos sustratos con bajo contenido en P (<1 ppm). No se utilizó régimen de fertilización en las plántulas inoculadas por la relación inversa entre la disponibilidad de P y la colonización de hongos micorrízicos (21, 22). A ello se atribuye que el sustrato 3, con alto contenido de P, no mostró diferencia significativa entre las plantas inoculadas y sin inocular. La actividad de la micorriza se inhibió por la presencia de P.

En los sustratos con bajo contenido en P en los que la inoculación con HMA se tradujo en mayor crecimiento, permitió acortar la etapa de aclimatación de 40 a 60 días.

CONCLUSIONES

Mediante la evaluación de parámetros de desarrollo de las plantas durante la aclimatación se demostró la acción de los hongos micorrízicos arbusculares como agentes de biorregulación del crecimiento, biofertilizantes y biocontrol.

Los resultados indican que su aplicación en la fase de aclimatación y vivero puede representar beneficios para los productores, reducción de costos de producción, manejo de productos orgánicos y la obtención de plantas con superior vigor y calidad en menor tiempo. ]]>
La incorporación de microorganismos benéficos en la agricultura intensiva es importante para lograr sistemas de producción sostenibles y ecosistemas con mayor capacidad de recuperación a condiciones adversas.

Notas al pie

^ADurán, F. V. I. ‘‘Situación y perspectivas de las cadenas agroindustriales 2014-2015’’ [en línea]. En: Anuario OPYPA 2014, edit. MGAP, Montevideo, 2014, pp. 15-38, [Consultado: 30 de junio de 2015], Disponible en: <http://www.mgap.gub.uy/OpypaPublicaciones/ANUARIOS/Anuario2014/pdf/Anuario_2014_web.pdf>.

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Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 3 de diciembre de 2015

Dra.C. Alicia Castillo Sallé, Unidad de Biotecnología INIA “Las Brujas” Ruta 48, km 10, Canelones Uruguay. Email: acastillo@inia.org.uy