Influence of chickpea (Cicer arietinum L.) interaction and the inoculation of selecting strains of Mesorhizobium spp.

Marisel Ortega García,^I M.Cs. Tomás Shagarodsky Scull,^I Dr. C. Bernardo L. Dibut Álvarez,^I M.Cs. Yoania Ríos Rocafull,^I M.Cs. Grisel Tejeda González,^I Dr. C. Luis A. Gómez Jorrin^II

^IInstituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical “Alejandro de Humboldt” (INIFAT), La Habana, Cuba.
^IIInstituto de Suelos (IS), La Habana, Cuba.

Contar con cepas microbianas que permitan la estimulación del crecimiento de especies vegetales de interés económico, es uno de los aspectos fundamentales a tener en cuenta para la elaboración de bioproductos que contribuyan a la sustentabilidad de los sistemas de producción. El objetivo de este trabajo fue seleccionar cepas de Mesorhizobium sp, efectivas para el incremento de los rendimientos en el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.), debido a la variabilidad que en los últimos años mostró la cepa INIFAT GR-1, recomendada en el Instructivo Técnico del mismo. Las cepas que resultaron positivas fueron purificadas y se les realizó una caracterización morfológica, fisiológica y bioquímica, mediante veinticuatro pruebas, que permitió la inclusión de dos de ellos dentro del género Mesorhizobium. La caracterización metabólica de estas cepas evidenció su superioridad con respecto a la INIFAT GR-1, teniendo en cuenta que presentan un aumento del halo de solubilización de fósforo de 0,18 cm y un incremento en la capacidad de producir ácido indol acético (AIA) entre 7 y 12 µgmL^-1. Demostró, en condiciones in vitro, su compatibilidad con Azotobacter chroococcum, Bacillus megatherium var phosphaticum, y Bacillus subtilis, y los plaguicidas Poncho, Celest Top, Gaucho FS-60, Gaucho MT, Yunta, Celest, TMTD, Cropstar y Apron Star. Respecto a los efectos bajo condiciones de campo ambas cepas propiciaron el crecimiento, desarrollo y rendimiento del garbanzo (vainas y granos) con valores estadísticos superior a los patrones empleados. Las cepas fueron crecidas en zaranda rotatoria a 200 r.p.m. de agitación a 32 ºC de temperatura de las que se obtuvo una concentración final de 10¹¹ UFC mL^-1, aproximadamente. El empleo de los mejores aislados provocó un efecto estimulador sobre el rendimiento de la variedad Nacional-29, superior al 42 %, con relación a las plantas controles.

Palabras clave: estrategia, estimulación, incremento.

ABSTRACT

The availability of microorganism strains with growth promoting effect on economically important species is one of the main aspects for elaborating bio-products, contributing to the sustainability of the production systems. The aim of this research was to select effective strains of Mesorhizobium sp to increase the yield of chickpea (Cicer arietinum. L), due to the variability shown by the INIFAT GR-1 strain over the last years, which is recommended in the technical instructions for this cultivar. Positive strains were purified and performed to conduct a morphological, physiological and biochemical characterization of the isolates, allowing the inclusion of two of them in the Mesorhizobium genre. The strain metabolic characterization showed its superiority with respect to INIFAT GR-1, as indicated by the increase in the phosphorus solubilization halo of 0,18 cm, and an increase of indol acetic acid (IAA) production ranging between 7-12 µgmL^-1. Its compatibility in vitro with Azotobacter chroococcum, Bacillus megatherium var phosphaticum, and Bacillus subtilis, as well as, with pesticides as Poncho, Celest Top, Gaucho FS-60, Gaucho MT, Yunta, Celest, TMTD, Cropstar and Apron Star was tested. Regarding the effects under field conditions, both strains promotes chickpea growth, development and yield (pods and grains), with values statistically superior to the pattern employed. They were growth in shaker conditions at 200 r.p.m. and 32 ºC of temperature with a final concentration of 10¹¹ UFC.mL^-1. The uses of the better strains produce the increase of Nacional-29 variety yield in 42 %, in comparison with no treated plants.

Key words: strategy, stimulation, increase.

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo correspondiente al aislamiento y caracterización de las cepas de Mesorhizobium sp, se realizó en el Laboratorio de Agrobiotecnología, del Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical “Alejandro de Humboldt” (INIFAT), ubicado en Santiago de Las Vegas, municipio Boyeros, provincia La Habana, Cuba. ]]>
Para el aislamiento se utilizaron raíces de 20 plantas de garbanzo de diferentes zonas del país: las Tunas, Artemisa y La Habana, provenientes de las variedades Nacional-27, Nacional-29 y Jamu-96. Los nódulos se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio al 5 % y se lavaron dos veces con agua destilada estéril; los mismos se maceraron en un tubo de ensayo. El extracto obtenido se sembró, sobre medio LMA con Rojo Congo^A. Las colonias crecidas se purificaron por agotamiento, fijando condiciones para su crecimiento de 28-30 ºC de temperatura durante 72 horas.

A los aislados obtenidos se les realizó la caracterización metabólica que incluyó el crecimiento de los mismos en medio LMA sin Rojo Congo, en placas Petri de 9 cm posterior a las 72 horas de incubación a 30 ºC de temperatura (6). La caracterización microscópica se determinó mediante la tinción de Gram y demostración de la presencia de cápsula. Se ejecutaron las siguientes pruebas: presencia de enzimas (oxidasa, catalasa); degradación de almidón y proteínas como gelatina y caseína. Utilización de citrato como fuente de carbono, producción de Indol a partir del triptófano, motilidad, Vogues Proskauer, Rojo de Metilo. También el uso de azufre a partir del crecimiento en medio Kliger y utilización de azúcares: manitol, maltosa, dextrosa, glucosa, fructosa, sacarosa y lactosa. Además, se determinó la degradación de celulosa y producción de ácido en el medio de cultivo LMA^B. Todos los ensayos fueron montados por triplicado.

Para la identificación se compararon los resultados obtenidos con la caracterización de la especie según el Manual de Sistemática para Bacterias (Bergey).

El potencial de solubilización se determinó en condiciones in vitro, a partir del crecimiento bacteriano sobre el medio Pikosvkaya^A. El medio se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121 ºC y 1,5 atmósferas. Las placas Petri de 9 cm se mantuvieron a 30 ºC de temperatura durante 48 horas, para cuantificar el halo de solubilización formado. Se realizaron tres réplicas para cada cepa, las que se sembraron por el Método de Colonia Gigante. El experimento se repitió en tres ocasiones.

Además se determinó la producción de ácido indol acético (AIA) siguiendo la metodología descrita (7). El experimento se realizó con tres repeticiones por cepa y como control negativo se utilizó el medio sin inocular. También se evaluó la compatibilidad de las cepas que se determinó mediante el Método de Difusión Zonal en Placas (6), utilizando como base el medio de cultivo Agar Mueller-Hinton inoculado con las cepas de Mesorhizobium sp seleccionadas. ]]>
Los pocillos de 7 mm de diámetro, se rellenaron con productos elaborados a partir de la fermentación de cepas de Azotobacter chroococcum (cepa INIFAT-12), Bacillus megatherium var phosphaticum (INIFAT Bmcub II) y Bacillus subtilis (INIFAT-101), todas ellas pertenecientes a la Colección de Microorganismos Beneficiosos del Departamento de Agrobiotecnología del Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical “Alejandro de Humboldt” (INIFAT). Después de 48 horas de incubación a 30 ºC de temperatura se determinaron las dimensiones del halo de inhibición presente en el medio. Para el resultado final se promedió el valor obtenido en las tres repeticiones realizadas. Para la evaluación de los resultados obtenidos se utilizó la escala propuesta (4), donde se considera que un halo de 0–0,25 cm (compatibles), de 0,26–0,50 cm (medianamente compatibles) y superior a 0,50 cm (incompatibles).

Los experimentos se ejecutaron sobre suelo Ferralítico Rojo (8) perteneciente a zonas agrícolas del Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical “Alejandro de Humboldt”, INIFAT, Santiago de las Vegas, durante tres campañas entre los años 2009-2012, con la variedad Nacional-29. Se empleó un diseño experimental de Bloques al Azar con cuatro réplicas, un tamaño de parcela de 30 m², seis surcos y cuatro tratamientos, para la evaluación se desecharon los bordes.

La aplicación del producto se realizó a partir de una suspensión del mismo en agua común a razón de 1:10 (v:v), embebiendo la semilla durante 10 minutos. Posterior al oreo se procedió a la siembra.

Se evaluaron como indicadores de crecimiento la altura de la planta, peso total de la planta, diámetro del tallo y peso seco de los nódulos. Se determinó además, de forma cualitativa, la presencia de nódulos en las raíces primarias y secundarias y la presencia de leghemoglobina (tonos de rosados a rojos) para los aspectos de mayor incidencia en la producción, se analizó el número y peso de las vainas y los granos por planta (9).

Los resultados de los experimentos realizados en condiciones de laboratorio in vitro fueron procesados teniendo en cuenta un Diseño Completamente Aleatorizado utilizado para su ejecución, mientras que los obtenidos en la fase experimental ejecutada en condiciones de campo fueron procesados considerando el Diseño de Bloques al Azar. Las diferencias significativas entre las medias de los tratamientos para las variables analizadas se discriminaron según la prueba de Rangos Múltiples de Duncan al 5 % de significación. El procesamiento de toda la información se realizó mediante el programa STATGRAPHICS Plus Versión 5.1 (10).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A partir del muestreo realizado a 20 plantas de garbanzo (Cicer arietinum L.) pertenecientes a diferentes variedades, se purificaron cinco aislados que mostraron las características típicas del género Mesorhizobium. En este caso se crecieron en medio LMA (colonias entre 0,1 y 0,3 cm de diámetro a las 48 horas de sembradas en el medio de cultivo, incubado a 32 ºC de temperatura) (6).

El objetivo de esta etapa de trabajo fue buscar heterogeneidad en la selección, para diseñar una estrategia basada en una amplia diversidad genética del cultivo, según las condiciones edafoclimáticas imperantes en cada región, para obtener inoculantes con mayor espectro de acción (11).

Referente a la descripción macromorfológica, los cinco aislados muestran mediante prueba de Tinción de Gram, que todos son Bacilos cortos Gram negativos y tienen presencia de cápsula. Todos coinciden con las características descritas para el género Mezorhizobium, por lo que, desde el punto de vista morfológico, no se puede descartar ninguno de ellos, para ser utilizados en la biofertilización del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.)^A.

La caracterización fisiológico-bioquímica (Tabla I), permitió diferenciar los microorganismos y eliminar a los aislados RM-2, RM-4 y RM-10 por presentar una reacción almidón positiva, respuesta que no coincide con las características al que pertenece el género implicado (6).
]]> Además de estas existen diversas características distintivas entre los géneros de rizobios. Por ejemplo Azorhizobium contiene cepas que forman nódulos de raíz y de tallo y fijan nitrógeno en condiciones de vida libre. Bradyrhizobium crece lentamente y producen álcali en medio YMA, mientras que Allorhizobiun, Rhizobium y Sinorhizobium crecen rápido y producen ácido en ese medio de cultivo. En el caso que nos ocupa como es el género Mesorhizobium, presenta colonias de crecimiento lento o moderado y produce ácido en medio LMA^A. El mismo incluye bacterias que presentan un alto grado de especificidad, que solo nodulan una muy estrecha gama de especies vegetales, por lo que se hace imprescindible una estrategia de manejo adecuada que permita contar con cepas que establezcan una relación eficiente (12).

A partir de estos resultados, el trabajo continuó solamente con las cepas R-1 y R-3, ya que son las que reúnen las características correspondientes al género Mesorhizobium, y por lo tanto, son las que presentan posibilidades en cuanto a inducir la nodulación en el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L), dada la especificidad de este microorganismo con su hospedero (13).

Para estas cepas se completó la caracterización fisiológica-bioquímica mediante la determinación de la utilización del algunos azúcares como fuente de carbono tales como (fructosa, glucosa, sacarosa, lactosa, maltosa, dextrosa y manitol) todos mostraron resultados positivos^A.

Para los rizobios se define su taxonomía sobre la base de la filogenia de los genes 16S rRNA, algunas características fenotípicas permiten distinguir entre los diferentes géneros. El estudio morfológico y fisiológico que comúnmente se lleva a cabo para la caracterización de estos microorganismos, permite al menos diferenciar géneros muy diferentes fenotípicamente entre sí como Bradyrhizobium, Mesorhizobium y la familia Rhizobiaceae (12).

Las cepas R-1 y R-3 fueron sometidas a un estudio más profundo de caracterización, para determinar su potencial metabólico, y posteriormente poder valorar la posibilidad de sustituir, con alguna de ellas, a la INIFAT GR-1, en la biofertilización del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.).
]]> La solubilización de fósforo es un proceso de gran importancia para los cultivos implicados en la interacción planta-microorganismo, ya que es uno de los componentes principales del ácido ribonucléico y desoxiribonucléico, además de ser el portador de energía de la molécula adenosina trifosfato (ATP) y de sus dos precursores mono y difosfato (AMP y ADP). Su presencia en las moléculas de ADN de los cromosomas permite los procesos de almacenamiento, replicación y conjuntamente con el ARN, la transcripción de información genética. Este elemento es regulador de la vegetación, por tanto es un factor que favorece los períodos críticos como son: la fecundación, maduración y movimiento de las reservas de la planta (14).

La presencia de este nutriente tiene gran importancia para la fijación biológica de nitrógeno durante la interacción rizobios-leguminosa, afectando, la carencia del mismo, el correcto funcionamiento del nódulo, por lo que la estimación de la actividad solubilizadora es sin dudas una herramienta para la selección de materiales (cepas) promisorios para la biofertilización, teniendo en cuenta que con la actividad solubilizadora, los microorganismos pueden aportar entre el 20-40 % de las necesidades de este nutriente para el cultivo (12).

Según los resultados que se muestran en la figura las cepas R-1 y R-3 presentan un halo de solubilización superior a 0,25, incluso superan en un alto por ciento a la cepa INIFAT GR-1 en la solubilización de fósforo in vitro, por lo que se puede inferir que las mismas tienen potencial para incrementar la disponibilidad de este nutriente, teniendo en cuenta la concordancia de estas pruebas con el comportamiento de los microorganismos en su ambiente natural (15).

Para los rizobios se describe la capacidad de solubilizar el fósforo contenido en el suelo mediante la acción de las enzimas fosfatasas y ácidos orgánicos, entre otras sustancias, al igual que las Pseudomonas, Bacillus y Enterobacter. Que las cepas presenten la dualidad en cuanto a la fijación de nitrógeno y solubilización de fósforo con tenores apreciables, resultan de interés para la elaboración de productos multipropósitos que beneficien los cultivos, y tiene, por lo tanto, particular trascendencia en este trabajo.

Otro proceso no menos importante, es la producción de fitohormonas por parte de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal, particularmente, el ácido indol acético (AIA). Mediante su liberación por parte de los microorganismos, se estimula el crecimiento de los cultivos a partir de diferentes mecanismos fisiológicos (12).
]]> Además posibilita la penetración del Rhizobium mediante el intercambio de señales bioquímicas diversas emitidas por el macro y microsimbionte. Este proceso infectivo, regulado y complejo, culmina con la formación en la planta de una estructura altamente organizada: el nódulo, que puede considerase como un nuevo órgano de la misma. En el mismo la bacteria se diferenciará en su forma endosimbionte fijadora de nitrógeno atmosférico (bacteroide). La transformación del microorganismo es tan importante que el mismo puede multiplicarse en vida libre y fijar nitrógeno en medios sintéticos especiales, pero no en ausencia del hospedero, existiendo con frecuencia una marcada especificidad entre ambos (4).

En el presente trabajo se valuaron los niveles de liberación de esta sustancia por parte de las dos cepas de Mesorhizobium, las mismas muestran valores de 20 µgmL^-1 con clara superioridad con respecto a la cepa INIFAT GR-1. Para este grupo de microorganismos se refiere la presencia de esta hormona dentro de sus productos metabólicos, y se atribuye a la misma, parte del efecto estimulador del crecimiento que se obtiene mediante su aplicación. Estos resultados guardan relación con lo reportado por otros autores para el género (16).

Existen estudios que demuestran la posibilidad de aplicar rizobios con otros microorganismos con potencial biofertilizante y demuestran efectividad de la inoculación combinada. En este estudio se demuestra que las dos cepas pueden combinarse con Azotobacter chroococcum (cepa INIFAT-12), Bacillus megatherium var phosphaticum (cepa INIFAT Bmcub II), y Bacillus subtilis (cepa INIFAT-101), al igual que con la INIFAT GR-1, ya que todas son compatibles por presentar halos de inhibición del crecimiento bacteriano entre 0,07-0,12 cm. Lo que demuestra que en un futuro se podrían realizar investigaciones donde se exploten los beneficios de las coinoculaciones de estos microorganismos (6).

Como parte de la caracterización a la que fueron sometidas las cepas de Mesorhizobium se incluyó su relación in vitro con plaguicidas químicos que tienen posibilidades de ser aplicados en el manejo del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.), teniendo en cuenta que este cultivo es altamente sensible a enfermedades, fundamentalmente a la afectación de hongos del suelo e insectos.

Existe coincidencia con la respuesta de los productos Cropstar y ApronStar, los que resultaron compatibles para las cepas de Mesorhizobium R-1 y R-3. Así como Poncho, Celest Top Gaucho FS-60 y Celest como medianamente compatibles con resultados muy similares a los que se evidencian frente a la INIFAT GR-1. Se destacan por su toxicidad los productos Gaucho MT, Yunta y TMTD. Resulta evidente la agresividad del Thiram como sustancia activa que compone dos de estos plaguicidas, por lo que se debe tener en cuenta para estudios posteriores con otros cultivos, los resultados obtenidos y valorar su compatibilidad especifica con cada cultivar, para evitar así errores de manejo agrícola.
]]> La influencia de la concentración de los productos utilizados puede condicionar la acción inhibitoria en algunos casos, teniendo en cuenta que los mismos se trabajaron de forma pura. Al disminuir su dosis, los efectos deben ser más leves sobre los microorganismos. Además, las condiciones in vitro implican una interacción máxima entre la sustancia química y la bacteria, lo que igualmente eleva la probabilidad de obtener resultados negativos. No obstante, la sensibilidad de las bacterias promotoras del crecimiento vegetal ante la presencia de fungicidas se describe también por otros autores^C.

De forma general, se considera que las cepas R-1 y R-3 podrían combinarse con los plaguicidas químicos, al igual que la cepa INIFAT GR-1, lo que sin dudas, sería de gran utilidad en la búsqueda de una propuesta de manejo integral del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.).

En la Tabla II se puede apreciar el potencial de ambas cepas de Mesorhizobium para estimular diferentes indicadores de crecimiento y desarrollo del cultivo del garbanzo, aunque se destaca la cepa R-3 con mayores incrementos en todos los indicadores de crecimiento y desarrollo evaluados.

Los resultados obtenidos demuestran un adecuado desarrollo del cultivo, así como el establecimiento de una relación positiva en la asociación planta y microorganismo que determinan el comportamiento de la especie vegetal. Además, brindan criterios para evaluar el desarrollo de la planta y su respuesta ante el tratamiento biológico; de ahí la necesidad de un régimen balanceado nutrición-biofertilización.

Durante la fase de desarrollo reproductivo, que se encuentra entre los 60 y 80 días, y que constituye una de las más importantes, al coincidir con el llenado del grano, requiere de mayores suministros para compensar la demanda y lograr el rendimiento esperado, por lo que la biofertilización juega un importantísimo papel, ya que coloca a disposición de la planta, los niveles de nitrógeno adecuados y el aporte de fósforo mediante la solubilización (14).
]]> Los nódulos se ubicaron fundamentalmente en la raíz principal, en forma de racimos de gran tamaño. En las raíces secundarias se detectó su presencia, caracterizada por un menor volumen en los mismos. En ambos casos se demostró, la presencia de la leghemoglobina, particularmente para las variantes inoculadas con las cepas R-1 y R-3. Este aspecto resulta muy importante porque demuestra que el proceso de fijación biológica de nitrógeno se realiza de forma efectiva, por lo que la asociación entre microorganismos y hospedero es satisfactoria (5).

Este trabajo permitió evaluar la ventaja de utilizar cepas autóctonas con alta capacidad de competencia, provenientes de nódulos de diferentes regiones y que muestran su potencial biológico. Teniendo en cuenta la efectividad de la asociación, inferida a partir del incremento en los indicadores de crecimiento, desarrollo y rendimiento evaluados, se puede concluir que las cepas utilizadas son capaces de competir con las nativas.

Resulta evidente la importancia de una correcta selección, para provocar un efecto adecuado en la estimulación del desarrollo del cultivo. En el tipo de suelo utilizado y con la variedad empleada, la cepa R-3 muestra una clara superioridad, de ahí lo imprescindible de realizar experimentos similares cuando se requiera discriminar entre cepas y seleccionar solo las de mayores potencialidades.

Los indicadores evaluados, como componentes del rendimiento, tienen una repercusión directa en la producción del cultivo, el que igualmente mostró incrementos por el efecto de la inoculación de las cepas de Mesorhizobium (Figura).

Es evidente la semejanza del comportamiento de las cepas R-1 y R-3, y la superioridad de ambas al compararla con la INIFAT GR-1, por lo que como resultado principal de este trabajo se seleccionan las mismas para sustituir a esta última en la biofertilización del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.), fundamentalmente para la variedad Nacional-29, debido a la respuesta significativamente superior con respecto al testigo (plantas sin aplicación de Mesorhizobium).
]]> En trabajos posteriores sería conveniente valorar la posibilidad de elaborar un producto multicepas que permita un mayor efecto de acción del inoculante en los distintos agroecosistemas donde se siembra el cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L.), así como la posibilidad de combinar estos microorganismos con especies solubilizadoras de fósforo y plaguicidas químicos o biológicos en condiciones in vivo, para proponer un manejo integral del cultivo.

Teniendo en cuenta que la inoculación de leguminosas con rizobios se llevará a cabo por mucho tiempo, la mejor opción para el manejo de este grupo de cultivos, es el continuo desarrollo de los biofertilizantes cada vez más efectivos que deberá ser un trabajo permanente y de vital importancia para la agricultura mundial y en especial para Cuba.

CONCLUSIONES

• Las cepas R-1 y R-3 pertenecen al género Mesorhizobium.
• Ambas cepas de Mesorhizobium, muestran potencialidades de uso para la agricultura, teniendo en cuenta que solubilizan fósforo, producen ácido indol acético en niveles superiores a la INIFAT GR-1 y, al igual que ella, son compatibles con microorganismos de interés agrícola y plaguicidas químicos.
• Las cepas R-1 y R-3 estimulan el rendimiento y la nodulación del cultivo del garbanzo (Cicer arietinum L) variedad Nacional 29, por lo que son promisorias para sustituir a la cepa INIFAT GR-1 en la biofertilización del mismo.
• Se destaca por su superioridad la cepa R-3 por mostrar incrementos en todos los indicadores evaluados.

Nota al pie

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Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 3 de diciembre de 2015