In vitro propagation of Moringa oleifera Lam. cultivars
Arturo Matos Ruiz, Iris Capote Betancourt, Aurora Pérez Martínez, Yarianne Lezcano Más, Carlos E. Aragón Abreu, Danilo Pina Morgado, Karel Vives Hernández, Marcos Daquinta Gradaille, Maritza Escalona Morgado
Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos del Centro Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila (UNICA), carretera a Morón km 9, Cuba, CP 69450.
RESUMEN
]]> La Moringa posee hojas, flores y frutos con un alto contenido de vitaminas, minerales y proteínas de interés para las industrias alimenticias y médicas. Su reproducción es por semillas y estacas, métodos insuficientes si se desean introducir nuevos cultivares. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer un protocolo para la propagación in vitro de Moringa oleifera Lam. La desinfección de las estructuras embrión-endospermo con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) se realizó a los cinco, siete y nueve minutos. La multiplicación in vitro se realizó por: sistemas convencionales (medio de cultivo semi-sólido) y biorreactores de inmersión temporal. En el enraizamiento in vitro se evaluó la concentración del ácido naftalen acético y el ácido indol butírico (0; 2,5; 5,0 y 7,5 µmol L-1) y el tipo de explante. Se evaluó la supervivencia de los brotes en la aclimatización teniendo en cuenta la procedencia de la fase de enraizamiento. Se determinó el efecto del genotipo en el establecimiento y la multiplicación in vitro. La desinfección del cultivar Supergenius fue mejor a los siete minutos, con un porcentaje de germinación del 54 %. Los biorreactores de inmersión temporal incrementaron la calidad morfológica de los brotes y el coeficiente de multiplicación aumentó de 6,2 a 16,1 para el cultivar Supergenius. El enraizamiento se logró sin auxinas y la supervivencia en aclimatización fue de un 85 % a los 35 días para los brotes que se enraizaron sin reguladores del crecimiento, independientemente del explante de procedencia. Se demostró que el genotipo influyó en el establecimiento y multiplicación de los mismos.Palabras clave: cultivares, protocolo, reguladores del crecimiento vegetal.
ABSTRACT
Moringa has leaves, flowers and fruit with a high level of vitamins, minerals and proteins of interest for the food and medical industries. This species can be propagated by seeds or cuttings, methods that not suitable to introduce new cultivars. The aim of this research was to establish an in vitro propagation protocol of different cultivars of Moringa oleifera Lam. To disinfect seeds three different disinfection times were evaluated five, seven and nine minutes in 10 gL-1 sodium hipoclorite. Two methods for in vitro micropropagation were used: conventional system (semi-solid culture medium) and temporary immersion bioreactor. In the in vitro rooting phase, four concentrations of the naphthalene acetic acid and Indole butyric acid auxins (0; 2,5; 5,0 and 7,5 µmol L-1) were evaluated and also the kind of explant. The survival rates of the sprout during the acclimatization phase was evaluated in relation to their origin in the rooting phase. Besides the effect of the genotype on in vitro establishment and multiplication was determined. The disinfection of the Supergenius cultivar was better at seven minutes of treatment with sodium hipoclorite, with 54 % of germination. The Temporary Immersion Bioreactor increased the sprouts morphological quality and multiplication coefficient from 6,2 until 16,1 of the Supergenius cultivar. Rooting was successful without auxin and acclimatization survival was around 85 % at 35 days for shoots rooted without growth regulators, regardless of explant origin. It was shown that the genotype influenced the establishment and multiplication of explants.
Key words: cultivars, protocol, plant growth regulators.
INTRODUCCIÓN
Moringa oleifera Lam es un árbol de la familia Moringaceae (1). Esta especie es nativa de la zona de la India, Afganistán, Pakistán (2). Por su alta resistencia a condiciones de estrés, en la actualidad se encuentra extendida en gran parte del mundo, incluyendo América (3).
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Esta planta es un recurso natural que posee gran utilidad como complemento alimenticio rico en vitaminas, antioxidantes, aceites, microelementos y proteínas (2). Además del beneficio para la industria alimenticia, en la medicina tradicional se utiliza para prevenir patologías asociadas a la carencia de elementos esenciales de la dieta, como la ceguera infantil (4).
Igualmente se le atribuyen usos en la purificación de agua (5) y en la obtención de biodiesel (6). Algunos autores le adjudican, también, actividad bio-estimulante para el crecimiento de algunos cultivosA. Recientemente se ha informado en la literatura la obtención de compuestos naturales a partir de esta planta para su uso a nivel agrícola y médico (5, 7).
Debido a estas propiedades, el cultivo de esta especie se ha incrementado en los últimos años (5). Los métodos tradicionales como la siembra de semillas y estacas han sido los más utilizados para satisfacer la relación consumo/demanda (8). Sin embargo, las inversiones de tiempo y dinero en podas, preparación de terreno, siembra y cosecha, son grandes y en ocasiones limitan las potencialidades de uso.
En los últimos años, las técnicas de cultivo in vitro se han utilizado en aras de obtener mayor cantidad de plantas de esta especie y ahorrar recursos materialesB; sin embargo, son escasos los informes que lo referencian. Esto crea la necesidad de profundizar en las investigaciones concernientes a este árbol de gran importancia en la seguridad alimentaria, salud y agriculturaB.
Los Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT®) se han utilizado con éxito para la propagación in vitro de plantas (9, 10). Estos sistemas semi-automatizados con el empleo del medio líquido favorecen la nutrición in vitro, así como la renovación de gases dentro del frasco de cultivo, lo que incrementa el crecimiento y el desarrollo de los brotes (9, 11). Además, se obtienen mejoras significativas en los indicadores morfo-fisiológicos de los brotes que garantizan mayor supervivencia y crecimiento de los mismos en condiciones ex vitro (12). El presente trabajo tuvo como objetivo establecer un protocolo para la propagación in vitro de Moringa oleifera Lam.
]]> MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se colectaron frutos de siete cultivares de Moringa oleifera Lam (Supergenius, Criolla Ciego de Ávila, PKM-2, Paraguay, Guatemala, Plain y Criolla Holguín), en diferentes áreas del territorio nacional. Para la obtención de las semillas, se secaron los frutos a temperatura ambiente durante una semana. A las semillas se les quitó el tegumento, se trabajó con las estructuras embrión-endospermo y se seleccionaron las que poseían entre 0,8 mm y 1 cm de diámetro; se lavaron con detergente comercial durante cinco minutos y se enjuagaron tres veces con abundante agua corriente.
Efecto del tiempo de desinfección de las semillas de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
La desinfección de los explantes (estructuras embrión-endospermo) se realizó con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) en agitación durante cinco, siete y nueve minutos. Posteriormente se colocaron individualmente en un tubo de ensayo con 10 mL de medio de cultivo que estuvo compuesto por el 100 % de las sales MS (14), suplementado con 20 g L-1 de sacarosa,
1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol y sin reguladores del crecimiento. El pH se ajustó a 5,7. Las condiciones de cultivo fueron de un fotoperíodo de 16 horas luz y ocho horas de oscuridad` y un flujo de fotones fotosintéticamente activos de 37 µmol m-2s-1 (Luxómetro digital FAITHFUL modelo FT-710) a temperatura de 26±1 °C.
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Se utilizaron 48 explantes por tratamiento. Después de siete días de cultivo se determinó el número de explantes contaminados. A los 21 días se evaluó el número de estructuras embrión-endospermo germinado y no germinado. Los resultados se expresaron en porcentaje.
Multiplicación in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
A partir de las estructuras embrión-endospermo germinadas se obtuvieron dos tipos de explantes: ápices (segmento de tallo de 3 cm aproximadamente con un par de hojas) y segmentos nodales (segmento de tallo de 3 cm aproximadamente con dos nudos y dos hojas). Todos los explantes se colocaron en un medio de cultivo semi-sólido que contenía el 100 % de las sales MS (13), suplementado con 30 g L-1 de sacarosa, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol y sin reguladores del crecimiento. El pH se ajustó a 5,7. La densidad de inóculo fue de siete explantes por frasco y el volumen de medio de cultivo fue de 25 mL. Las condiciones de cultivo se mantuvieron igual que en el experimento anterior. Los explantes se subcultivaron tres veces cada 21 días, manteniendo la misma composición del medio de cultivo.
Posteriormente se tomaron diez segmentos de tallos de aproximadamente 3 cm de longitud con dos nudos y dos hojas provenientes de la multiplicación convencional y se colocaron en Biorreactores de Inmersión Temporal (BIT®) (14) que contenían 800 mL de medio de cultivo líquido con igual composición que el anterior. Se realizaron tres inmersiones por día y el tiempo de inmersión fue de cuatro minutos. Se utilizaron tres BIT y cada explante constituyó una unidad experimental. Las condiciones de cultivo se mantuvieron igual que en el experimento anterior. Después de 21 días de cultivo se evaluaron los indicadores número de brotes por explante, longitud del brote, número de entrenudos, número de raíces, grosor del tallo, presencia de brotes hiperhídricos y además se calculó el coeficiente de multiplicación como el cociente entre el número de brotes finales y el número de explantes inicial.
Enraizamiento in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius Para el enraizamiento in vitro, se utilizó un medio de cultivo semi-sólido que estuvo compuesto por las sales MS (13), suplementado con 40 g L-1 de sacarosa, 1 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de mio-inositol y los reguladores del crecimiento ácido naftalen acético (ANA) y ácido indol butírico (AIB) en varias concentraciones (0; 2,5; 5,0; y 7,5 µmol L-1). El pH se ajustó a 5,7. Se utilizaron dos tipos de explantes, el de las bases de tallos de 3 cm de longitud aproximadamente con dos nudos y dos hojas y el segmento de tallo de 3 cm de longitud aproximadamente, con dos nudos y dos hojas. La densidad de inóculo fue de siete explantes por frasco y el volumen de medio de cultivo fue de 25 mL. Se mantuvieron las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Se utilizaron 30 explantes por tratamiento. Cada explante constituyó una unidad experimental.
A los 21 días de cultivo, se evaluaron los indicadores altura de los brotes, número de entrenudos, número de raíces, longitud y grosor de la raíz más extensa. ]]>
Aclimatización de las plantas de Moringa oleifera Lam cv Supergenius Los brotes de aproximadamente 5 cm de longitud, con cuatro hojas y presencia de raíces provenientes de los diferentes tratamientos de enraizamiento in vitro, se colocaron en comprimidos de turba (jiffys). Las condiciones de cultivo fueron de 80±3 % de humedad relativa y 25±2 °C de temperatura (Termo Higrómetro digital TECPEL® modelo DTM- 303), fotoperíodo correspondiente al ciclo del día (16 horas luz/8 horas oscuridad) con un flujo de fotones fotosintéticamente activos de 608 µmol m-2s-1 y condiciones atmosféricas de concentración de CO2 entre 375 y 400 µmol mol-1 a las 12:00 pm. El riego se realizó con regadera una vez por día en el horario comprendido entre las 9?30 am y 11?00 am. Se utilizaron 30 plantas por tratamiento. Cada planta constituyó una unidad experimental.
A los 7, 14, 21, 28 y 35 días de cultivo se calculó el porcentaje de supervivencia de acuerdo con la fórmula:
% de supervivencia= (número de plantas vivas/total de plantas) x100
Efecto del genotipo en la germinación de semillas de Moringa oleifera Lam
A las semillas de los siete cultivares de Moringa oleifera Lam (Supergenius, Criolla Ciego Ávila, PKM-2, Paraguay, Guatemala, Plain y Criolla Holguín) se les realizó la desinfección de las estructuras embrión-endospermo con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) en agitación durante siete minutos. Se mantuvieron las condiciones de cultivo descritas para la germinación del cultivar Supergenius. ]]>
Se utilizaron 48 estructuras embrión-endospermo por cultivar. Después de siete días de cultivo se determinó el número de explantes contaminados. A los 21 días se evaluó el número de estructuras embrión-endospermo germinado y no germinado. Los resultados se expresaron en porcentaje.
Efecto del genotipo en la multiplicación de Moringa oleifera Lam
Para evaluar el efecto del genotipo en la multiplicación se procedió de igual manera que con el cultivar Supergenius descrito previamente. Después de 21 días de cultivo en BIT se evaluaron los indicadores número de brotes por explante, longitud del brote, número de entrenudos, presencia raíces, grosor del tallo y presencia de brotes hiperhídricos. Además, se calculó el coeficiente de multiplicación como el cociente entre número de brotes final y número de explantes inicial.
Análisis estadístico
En el procesamiento estadístico de los datos se utilizó el utilitario SPSS (15), el análisis de varianza simple, bifactorial y trifactorial (ANOVA) con diferentes niveles. Las medias de los tratamientos se compararon utilizando la prueba de rangos múltiple de Tukey (p<0,05). En algunos casos fue necesaria la transformación de los datos para lograr los supuestos de las pruebas paramétricas realizadas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del tiempo de desinfección de las semillas de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
En la Tabla I se muestra el efecto del tiempo de desinfección con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) sobre el porcentaje de estructuras embrión-endospermo contaminadas, germinadas y no germinadas durante el establecimiento in vitro. El menor porcentaje de contaminación se obtuvo cuando la desinfección se realizó durante nueve minutos, con diferencias significativas del resto de los tratamientos. Por su parte, el mayor porcentaje de germinación le correspondió al tratamiento donde se utilizó el hipoclorito de sodio 1 % (V:V) durante siete minutos, el cual difirió significativamente de los tratamientos de cinco y nueve minutos. También se pudo observar que con el aumento del tiempo de desinfección aumentó el porcentaje de semillas no germinadas a pesar de que el porcentaje de contaminación fue menor. Este comportamiento pudiera estar relacionado con un efecto fitotóxico del hipoclorito de sodio (16). A partir de estos resultados se seleccionó el tiempo de siete minutos como el adecuado para la desinfección de las semillas de moringa.
Multiplicación in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
En la multiplicación de M. oleifera Lam. cv Supergenius en el sistema convencional se obtuvo un elevado coeficiente de multiplicación (6,2) a pesar de no utilizar reguladores del crecimiento en el medio de cultivo. Esto pudiera asociarse fundamentalmente a la juvenilidad del material vegetal y a la ruptura de la dominancia apical que favoreció la activación de la brotación axilar así como, a un elevado contenido endógeno de fitohormonas como la zeatinaA (17), lo que pudo favorecer la formación de brotes axilares. ]]>
El uso de los BIT incrementó el coeficiente de multiplicación hasta 16,1 (Tabla II), demostrando el efecto positivo de este sistema de cultivo en la multiplicación de la M. oleifera Lam. cv Supergenius. Además, los indicadores morfológicos evaluados mostraron resultados favorables. El uso del medio de cultivo líquido y la renovación de la atmosfera gaseosa interna del recipiente de cultivo favorecieron la incorporación y asimilación de los nutrientes, incrementando el crecimiento y la acumulación de biomasa (14, 18).
Enraizamiento in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
El efecto de la concentración de dos auxinas (ANA y AIB) y el tipo de explante sobre indicadores morfológicos en la fase de enraizamiento in vitro de brotes de Moringa oleifera Lam. cv. Supergenius se muestran en la Tabla III. El número de raíces fue mayor cuando se utilizó como explante segmentos de tallos con 5,0 µmolL-1 de ANA y 7,5 µmolL-1 de AIB, sin diferencias significativas entre sí.
La longitud de la raíz más extensa fue mayor en el control, independientemente del tipo de explante, sin diferencias significativas con el tratamiento en que se utilizaron bases de tallo con 2,5 µmol L-1 de ANA. Este tratamiento también mostró el mejor resultado en cuanto al grosor de la raíz más extensa y la altura del brote, con diferencias significativas del resto de los tratamientos. El número de entrenudos fue superior para los segmentos de tallos del tratamiento control, con diferencias significativas con el resto de los tratamientos. ]]>
En los explantes proveniente de la base del tallo se favoreció la formación de callo en la región basal, lo que afectó la formación de raíces. Esto pudiera estar relacionado con el incremento endógeno de la concentración de auxina, ya que se reconoce que la Moringa posee un elevado contenido de AIA y la adición exógena de ANA y AIB pudo provocar la división celular descontrolada dando lugar a la masa callosa (19). Esta condición en los explantes es no deseada ya que las raíces que se forman a partir de esta estructura son de baja calidad (20).
Aclimatización de brotes de Moringa oleifera Lam cv Supergenius
La Tabla IV muestra el efecto de la aplicación de auxinas (ANA y AIB) durante el enraizamiento in vitro sobre en el porcentaje de supervivencia de los brotes en la fase de aclimatización. El uso de auxinas en la fase de enraizamiento in vitro, independientemente del tipo y concentración, afectó notablemente la supervivencia de los brotes durante el transcurso del tiempo. El tratamiento control, donde no se utilizaron auxinas para el enraizamiento, mostró los mejores valores de supervivencia en todos los momentos evaluados, independientemente del tipo de explante utilizado. Luego de 35 días de cultivo la supervivencia fue de superior al 85 % para el tratamiento control. Para los tratamientos donde se utilizaron auxinas los valores de supervivencia al final de esta fase fueron muy bajos oscilando entre 0 y 6,6 %.
El comportamiento observado pudiera estar asociado a que las raíces formadas in vitro son poco funcionales y con escasos pelos adsorbentes, lo que no garantiza la nutrición de los brotes en la etapa inicial de la aclimatización (21). Además, en algunas plantas, las raíces in vitro se pierden durante el trasplante al sustrato, por lo que durante este proceso donde las plantas tienen que adaptarse a las nuevas condiciones de cultivo y enfrentar las condiciones de estrés a las que son expuestas durante el tránsito in vitro-ex vitro podría afectar el porcentaje de supervivencia.
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La aplicación de auxinas promovió el enraizamiento de los brotes; sin embargo, en el tratamiento control las raíces que se formaron son más funcionales, lo que garantizó la supervivencia durante la aclimatización. Esto pudiera estar asociado a que el suplemento de auxinas favorece la formación de callos en la base de los brotes que impide la funcionabilidad de las raíces en condiciones ex vitro afectando la supervivencia de las plantas.
Efecto del genotipo en la germinación de semillas de Moringa oleifera Lam
En la Tabla V se muestra el efecto de la desinfección durante siete minutos con hipoclorito de sodio 1 % (V:V) sobre el porcentaje de estructuras embrión-endospermo contaminadas, germinadas y no germinadas durante el establecimiento in vitro de M. oleifera Lam cv Paraguay, Plain, PKM-2, Guatemala, Criolla Ciego Ávila, Criolla Holguín. Para los cultivares evaluados el porcentaje de contaminación fue inferior al del cultivar Supergenius, con excepción del cultivar Criolla Holguín que mostró un porcentaje de contaminación de 95,80 %. El mayor porcentaje de germinación se logró en los cultivares Criolla Ciego Ávila y Plain, sin diferencias significativas entre sí. Estos valores de germinación fueron superiores al obtenido con el cultivar Supergenius. La germinación del resto de los cultivares fue baja. El cultivar Criolla Holguín se vio severamente afectado por la contaminación y la no germinación de las estructura embrión-endospermo, por lo que no se pudo continuar con la experimentación con este cultivar.
Efecto del genotipo en la multiplicación de Moringa oleifera Lam
Los valores de coeficiente de multiplicación en sistema convencional de los cultivares de M. oleifera Lam (Paraguay, Plain, PKM-2, Guatemala y Criolla Ciego Ávila), se muestra en la Tabla VI. Los mejores resultados se obtuvieron con los cultivares Supergenius, Plain y Paraguay, sin diferencias estadísticas significativas entre sí. Los resultados más bajos se obtuvieron con el cultivar Criolla Ciego Ávila a pesar de ser la que mejores resultados mostró en cuanto a germinación de las estructuras embrión-endospermo con el 91,60 %. ]]>
Los valores de los indicadores morfológicos evaluados luego de la multiplicación en BIT de M. oleifera Lam se muestran en la Tabla VII. Para el indicador longitud del brote, los mejores resultados se obtuvieron para los cultivares Supergenius, Paraguay y Plain, sin diferencias estadísticas entre sí. Por su parte, el número de entrenudos fue superior en los cultivares Supergenius, Paraguay y PKM-2, sin diferencias estadísticas entre sí.
La formación de raíces se evidenció en todos los cultivares, excepto en Paraguay y Criolla Ciego Ávila, presentándose el mayor número de raíces en los cultivares Supergenius y PKM-2, sin diferencias significativas entre sí. El indicador grosor del tallo no mostró diferencias significativas entre los cultivares evaluados. Tampoco, se presentaron brotes hiperhídricos en ninguno de los cultivares. En cuanto al coeficiente de multiplicación, el mejor resultado le correspondió al cultivar Supergenius, seguido por el cultivar Paraguay. Para estos cultivares, el BIT incrementó en más de dos veces el coeficiente de multiplicación, mientras que para el resto de los cultivares este indicador no tuvo un incremento significativo con respecto al sistema convencional.
Los resultados demostraron el efecto del genotipo sobre la germinación de las estructuras embrión-endospermo y la multiplicación in vitro. Las diferencias observadas entre los cultivares pudieran estar relacionadas con el estado fisiológico y sanitario de la planta madre y de las semillas, así como el tamaño, edad y momento de toma de los explantes. Además, se conoce que la respuesta genotípica depende de la expresión génica de cada individuo, la cual depende del medio ambiente donde se desarrolla el individuo (22).
CONCLUSIONES
Se logró un protocolo para la propagación in vitro de cultivares de Moringa oleifera Lam, el cual se caracterizó por su efectividad en el número y calidad de los brotes. El mismo se caracterizó por la ausencia de reguladores del crecimiento durante el establecimiento, la multiplicación y el enraizamiento de los brotes lo cual incidió positivamente en los altos porcentajes de supervivencia logrados durante la aclimatización.
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Con el empleo de la técnica de inmersión temporal se alcanzó duplicar la tasa de multiplicación en algunos cultivares demostrando la efectividad de este método en la propagación de esta planta. Es evidente que los contenidos endógenos de auxinas y citoquininas en esta planta favorecieron la propagación in vitro, por lo que la obtención de extractos naturales y su evaluación en la morfogénesis in vitro de otras plantas son de gran interés y constituyen aspectos a abordar en futuras investigaciones.
Nota al pie
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22. Orellana, P. P.; García, L.; Bermúdez, I.; Veitía, N. y Romero, C. ‘‘Manejo de hijos y ápices de cultivares de Musa spp. para iniciar la micropropagación y comportamiento durante seis subcultivos in vitro’’. Biotecnología vegetal, vol. 2, no. 2, 2002, pp. 77-81, ISSN 1609-1841.
Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 29 de enero de 2016
Arturo Matos Ruiz, Laboratorio de Cultivo de Células y Tejidos del Centro Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila (UNICA), carretera a Morón km 9, Cuba, CP 69450. Email: aruiz@bioplantas.cu
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