Citotoxic activity of an aspartic peptidase from Salpichroa origanifolia against the infection caused on green zucchini (Cucurbita maxima, var. Zapallito) by Phytophthora capsici
Dra.C. Gabriela F. Rocha,I Dra.C. María E. Díaz,I,II Dra.C. Adriana M. Rosso,I Dra.C. Mónica G. ParisiI
ILaboratorio de Química Biológica, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Argentina.
IICONICET.
Phytophthora capsici es un oomicete patógeno que causa importantes pérdidas en la producción de cultivos de interés agroeconómico. Los agroquímicos utilizados tradicionalmente para combatir estos fitopatógenos causan efectos adversos sobre la salud y el medio ambiente. Las plantas de la flora autóctona representan una fuente alternativa de metabolitos antifúngicos naturales. En nuestro laboratorio hemos estudiado la especie Salpichroa origanifolia, una hierba perenne autóctona del Norte y Centro de Argentina cuyos frutos, en forma de baya ovoide, son comestibles. A partir del extracto crudo de los frutos maduros de esta especie se purificó por cromatografía de intercambio iónico mediante un proceso en batch, una aspartil peptidasa a la cual denominamos salpichroína. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto antifúngico de la enzima sobre el patógeno P. capsici. Salpichroína presentó un elevado efecto citotóxico sobre P. capsici en los ensayos in vitro, con un valor de CIM de 1,2 µmol L-1. Para evaluar el efecto de la enzima sobre el desarrollo de P. capsici en vegetales, se realizaron bioensayos de inoculación controlada de zapallitos verdes (Cucurbita máxima var Zapallito), observándose que los zapallitos inoculados con salpichroína junto con el fitopatógeno permanecieron asintomáticos durante siete días.
Palabras clave: fungicidas, organismos patógenos, peptidasas.
ABSTRACT
Phytophthora capsici is a phytopathogenic agent that causes significant losses in crops of economic interest. The chemicals traditionally used to fight these pathogens cause adverse effects on health and the environment. Native plants represent an alternative source of natural antifungal metabolites. In our laboratory we have studied a perennial herb, Salpichroa origanifolia, native to the northern and central Argentina whose ovoid fruits are edible berry. An aspartyl peptidase from the crude extract of the ripe fruit of this species was purified by ion exchange chromatography using a batch process. The enzyme was called salpichroín. In this work the antifungal effect of the aspartyl peptidase on P. capsici was studied. It was obtained that salpichroín had a high cytotoxic effect in vitro on strains of P. capsici (MIC: 1.2 µmol L-1). To evaluate the enzyme effect on the development of P. capsici in vivo, inoculation controlled bioassays on green zucchini (Cucurbita maximum var Zapallito) were performed. The fruit inoculated with the phytopathogen and salpichroín remained asymptomatic for seven days.
Key words: fungicides, pathogens, peptidase.
INTRODUCCIÓN
Los hongos fitopatógenos son la principal causa de enfermedades infecciosas en las plantas. El control de estos hongos con fungicidas sintéticos es aún la medida fitotécnica más importante para aumentar los rendimientos de los cultivos. Sin embargo, la utilización masiva y a veces indiscriminada de estos productos ha incrementado la resistencia de los organismos fitopatógenos además de provocar efectos adversos en la salud humana y el medio ambiente (1). En este marco se plantea como esencial la búsqueda de agentes antimicrobianos más seguros que puedan sustituir o disminuir el actual uso de agroquímicos. El desarrollo de una agricultura sostenible ha llevado a investigadores de todo el mundo a buscar nuevos compuestos para el control de enfermedades cuya actividad y seguridad ambiental sea adecuada (2). En este sentido, se están evaluando alternativas naturales, entre las cuales se encuentra el uso de extractos vegetales. Con estos extractos se han obtenido resultados prometedores ya que se ha demostrado la actividad antimicrobiana de diferentes extractos de plantas in vitro e in vivo (3, 4, 5). ]]>
Las plantas han desarrollado un sofisticado sistema inmune innato en respuesta a los patógenos invasores. Es así como la defensa de las plantas implica una variedad de mecanismos celulares entre los que podemos mencionar la generación rápida de especies reactivas de oxígeno (ROS), la inducción de la respuesta hipersensible (HR) y la producción de moléculas pequeñas (fitoalexinas) y proteínas con actividad antimicrobiana. También se ha descripto la inducción de genes que codifican endopeptidasas con distintos mecanismos catalíticos (6, 7). Las peptidasas cisteínicas están involucradas en muchos aspectos del desarrollo y fisiología de las plantas incluyendo senescencia, embriogénesis, desarrollo de flores y respuesta a distintos tipos de estrés ambiental (8). Además, la acción farmacológica de las peptidasas cisteínicas de plantas ha sido reconocida en investigaciones como potenciales drogas para combatir enfermedades bacterianas y fúngicas (9, 10). Por otro lado, las peptidasas aspárticas (APs) de origen vegetal han sido descriptas como una parte fundamental del mecanismo de defensa de las plantas frente a la infección por microorganismos patógenos (11).
En nuestro laboratorio hemos estudiado la especie Salpichroa origanifolia, una hierba perenne autóctona del Norte y Centro de Argentina, Uruguay y Brasil. Los frutos de esta especie tienen forma de baya ovoide, son comestibles y comúnmente llamados huevitos de gallo. En extractos crudos de los frutos maduros se encontró una peptidasa. A partir de dicho extracto se purificó por cromatografía de intercambio aniónico y caracterizó esta AP a la cual denominamos salpichroína (12).
Por otra parte, se ha descrito que el oomicete P. capsici causa la putrefacción y tizón tardío de una gran variedad de huéspedes, incluidos muchos de los miembros de la familia Solanaceae y Cucurbitaceae así como Fabaceae. Entre los cultivos de interés agroeconómico afectados se encuentran los cultivos de papa, de batata, de tomate, de pimiento, de berenjena y de zapallitos. Es por ello, que el presente trabajo tuvo como objetivo determinar la actividad citotóxica de la AP purificada a partir de frutos maduros de S. origanifolia frente a la infección causada por
P. capsici en zapallitos verdes (Cucurbita maxima, var. Zapallito).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal: Como fuente de enzimas proteolíticas se emplearon los frutos maduros de la especie Salpichroa origanifolia (Lam.) Baill. recolectados en la localidad de Luján, provincia de Buenos Aires, República de Argentina. El fruto maduro es una baya ovoide, blanda, de color blanquecino y sabor dulce. ]]>
Preparación del extracto crudo: Los frutos se trituraron con etanol a -8ºC. El precipitado se resuspendió en buffer fosfato de potasio 50 mM de pH 7,0 (4°C) y se obtuvo un extracto al 15% (p/V). Esta preparación enzimática se denominó extracto crudo (EC).
Determinación de la actividad proteolítica: La determinación de la actividad proteolítica fue realizada utilizando caseína como sustrato (13). La reacción se inició con el agregado de 100 µL de la solución enzimática a 900 µL de solución de caseína al 0,5 % (p/V) en buffer fosfato de potasio 50 mM de pH 6,0 y luego de 15 minutos de incubación a 40 °C, la reacción se detuvo con el agregado de 1 mL de TCA al 5 % (p/V). La suspensión se dejó en reposo durante 20 minutos en baño de hielo y luego fue centrifugada durante 10 min a 14000 rpm. Se midió la absorbancia del sobrenadante a 280 nm para determinar los péptidos solubles obtenidos por digestión proteolítica. La Unidad de actividad caseinolítica (Ucas) fue definida como la cantidad de enzima necesaria para producir un incremento de una unidad de absorbancia por minuto a 280 nm en las condiciones del ensayo.
Determinación de la concentración de proteínas: La concentración de proteínas fue estimada por el método de Bradford (14) empleando albúmina sérica bovina como estándar para la construcción de la curva de calibración.
Purificación de la AP: La purificación se llevó a cabo mediante cromatografía de intercambio aniónico con una resina de DEAE-Sepharose Fast Flow (Sigma) equilibrada en buffer fosfato de potasio 50 mM de pH 7,0. Las proteínas fueron eluidas con un gradiente lineal de NaCl (0,0-0,6 M) con un flujo constante de 1 mL min-1. La fracción activa fue desalada por cromatografía de exclusión molecular con resinas de Sephadex G-10 y almacenada a -20 °C para posteriores ensayos. La fracción activa eluída de la columna cromatográficas fue analizada por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida (15 %), en condiciones reductoras y no reductoras y a temperatura ambiente (15). Los geles fueron teñidos con Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB R-250) y con plata (16). En la electroforesis SDS-PAGE se emplearon patrones de bajo peso molecular (Low Molecular Weight Range Sigma Marker producto N° 3913M). Para los zimogramas se aplicó la técnica de Kleiner y Stetler-Stevenson (17). Después de la corrida electroforética, el gel se incubó durante la noche en buffer de citrato de sodio (pH 4,0) con CaCl2 20 mM a 40 °C. Luego del lavado, el gel se tiñó con CBB R-250 para el análisis de zimografía. El desarrollo de una banda clara en el fondo azul del gel indicó la presencia de actividad de la peptidasa.
Actividad antifúngica in vitro: El fitopatógeno empleado en este estudio (P. capsici) fue aislado y caracterizado por el grupo de investigación de Fitopatología de la Universidad Nacional de Luján, a partir de vegetales de producción local, de la zona Noreste de la provincia de Buenos Aires. Para determinar la actividad antifúngica de salpichroína, discos de agar de 0,5 cm de diámetro con crecimiento de micelio de la cepa fúngica estudiada fueron incubados con salpichroína (2,4 µmol L-1), buffer fosfato de sodio 50 mM de pH 7,0 o agua durante 24 horas. Los discos de agar fueron luego colocaron en placas de Petri que contenían medio V8 (34 % de jugo de ocho vegetales V8® y 3 % de agar) específico para el crecimiento de P. capsici. Se colocó un disco de agar por placa y los ensayos se realizaron por duplicado. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente durante diez días. Al cabo de tres y diez días se controló el efecto inhibitorio de la enzima sobre el crecimiento del micelio de la especie fúngica. ]]>
La concentración inhibitoria mínima (CIM) se definió como la concentración mínima de salpichroína que produjo total inhibición en el crecimiento de P. capsici. Para ello, se incubó un disco de agar de 0,5 cm de diámetro con crecimiento de micelio de la cepa fúngica con distintas concentraciones de la enzima (0,0- 0,6- 1,2- 2,4 µmol L-1) en medio líquido V8 (10 %) a 25°C durante 48 horas. La CIM se determinó visualmente y correspondió a la menor concentración de salpichroína en la que no hubo desarrollo miceliar del oomicete.
Inoculación controlada del fitopatógeno P. capsici sobre zapallitos verdes: Para evaluar el efecto de salpichroína sobre el desarrollo de P.capsici en vegetales se realizaron bioensayos de inoculación controlada. Se emplearon zapallitos verdes (Curcubita máxima var Zapallito), adquiridos en comercios de la ciudad de Luján, Bs As. En primer lugar se lavó cuidadosamente la superficie del vegetal con agua, para no producir lesiones. Se hicieron heridas de 3 mm de profundidad en la región ecuatorial del vegetal con una aguja de disección estéril para favorecer la infección. El bioensayo consistió en colocar un disco de agar del medio de cultivo V8 con micelio de P. capsici en activo crecimiento sobre la herida realizada en la piel de los zapallitos limpios. Sobre el cultivo se colocó 50 µL de una solución estéril de salpichroína (2,4 µmol L-1) o el mismo volumen de agua estéril para el caso del control positivo. Para los controles negativos se usaron discos de agar estéril, sin enzima ni el patógeno. Para cada tratamiento se hicieron tres réplicas y el ensayo completo se repitió dos veces. Todos los vegetales fueron incubados a 25 ºC en cámara húmeda y con luz alternada.
El desarrollo de la infección se evaluó diariamente desde los dos días después de la inoculación y durante siete días, registrándose como el porcentaje de heridas infectadas por réplica y calculando la media y la desviación estándar para cada tratamiento.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento y caracterización de la enzima pura
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Se preparó un EC de frutos maduros de Salpichroa origanifolia cuya concentración de proteínas fue de 0,5 mg mL-1 y con una actividad proteolítica de 145 Ucas mL-1. Si bien en trabajos previos se realizó la purificación de la enzima mediante un sistema FPLC (12), en este trabajo la purificación a partir del EC se realizó en batch utilizando una cromatografía de intercambio aniónico con una resina DEAE-Sepharose. Esta técnica permitió obtener una mayor biomasa de enzima pura necesaria para ser utilizada en los ensayos de inhibición microbiana. En el perfil cromatográfico se observaron cinco picos de absorbancia a 280 nm de los cuales sólo uno presentó actividad caseinolítica (Figura 1A). La fracción activa obtenida fue analizada por electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Se observó una única banda con peso molecular aparente de 32 kDa cuando la muestra se preparó en condiciones no reductoras (Figura 1B, calle 2). No se observaron diferencias en el perfil electroforético cuando la muestra se preparó en condiciones reductoras y calentadas a 90°C (dato no mostrado). La pureza de la enzima fue evaluada también por electroforesis nativa y se observó la presencia de una única banda proteica (Figura 1B, calle 4). De la misma manera, en el zimograma correspondiente se observó una única banda con movilidad relativa similar a la obtenida en el gel, indicando la homogeneidad de la enzima purificada.
De acuerdo con los resultados obtenidos en los ensayos electroforéticos, se estimó el peso molecular de la enzima salpichroína en 32 kDa, valor que es del mismo orden que el obtenido para otras APs de origen vegetal como las APs de tomate (37 kDa) (18) y tabaco (36-40 kDa) (19), la AP de papa (38 kDa) (20) y la AP de Ficus racemosa (44 kDa) (21).
Actividad antifúngica de salpichroína
Se ha informado en la bibliografía la presencia de múltiples actividades biológicas asociadas a las peptidasas, entre ellas la actividad antifúngica. Se encontró que la bromelina purificada a partir de los tallos de piña era un potente inhibidor de patógenos fúngicos de plantas y que esa actividad estaba asociada a su actividad proteolítica (7). Por otra parte se informó que la actividad antifúngica de las APs de papa estaba relacionada con la presencia del PSI en la enzima madura (22). Por este motivo se inició el estudio de la actividad antifúngica de salpichroína.
En primer lugar se evaluó el efecto inhibidor de la enzima sobre el desarrollo miceliar de P. capsici (sección Materiales y Métodos). En los ensayos microbiológicos, se encontró que la enzima ejercía un fuerte efecto citotóxico sobre cepas de P. capsici ya que no se observó desarrollo del micelio luego de la incubación en la solución enzimática durante los diez días del ensayo (Figura 2). Como era de esperar, se observó desarrollo del micelio de las cepas en las placas que contenían los discos sumergidos en agua y en buffer.
En base a estos resultados podemos inferir que salpichroína presenta interesantes propiedades antimicrobianas sobre el crecimiento in vitro del fitopatógeno P. capsici, oomicete que genera grandes pérdidas en la producción de vegetales como zapallitos, pimientos y berenjenas entre otros.
Con el fin de comprobar la actividad citotóxica in vivo de la enzima, se llevaron a cabo experimentos de inoculación controlada de salpichroína sobre zapallitos verdes infectados por P. capsici.
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El bioensayo consistió en colocar un disco de agar con micelio de P. capsici en activo crecimiento en la piel de zapallitos limpios. Sobre el cultivo se colocó una solución estéril de salpichroina (2,4 µmol L-1) o el mismo volumen de agua estéril para el caso del control positivo. Para los controles negativos se usó solo un disco de agar sin ningún tratamiento previo. Se incubó a 25 °C en cámara húmeda durante siete días y se registró la severidad de la lesión. Después de la incubación se observaron signos de patogenicidad sobre todos los controles positivos.
Las muestras tomadas de la superficie de dichos frutos confirmaron que se trataba de P. capsici debido a la presencia de esporangios con pedicelos típicamente largos (Figura 4 A).
Los zapallitos sobre cuyos inóculos fue colocada la solución de enzima no presentaron signos de infección y al igual que los controles negativos permanecieron asintomáticos (Figura 4 B). Este comportamiento se repitió en todas las réplicas del ensayo.
De acuerdo a estos resultados, la aspartil peptidasa salpichroína aislada de frutos maduros de S. origanifolia, podría controlar la infección de P. capsici sobre zapallitos verdes, en la etapa de poscosecha.
CONCLUSIONES
AGRADECIMIENTOS
Los resultados de este trabajo son parte de la tesis doctoral de la Ing. Gabriela Rocha. Agradecemos el financiamiento recibido del Departamento de Ciencias Básicas de la Universidad Nacional de Luján, del Programa de Subsidios para Investigación de la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires (CIC 2013) y del Programa de Redes Internacionales de la Secretaría de Políticas Universitarias del Ministerio de Educación de la República Argentina.
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Recibido: 15 de mayo de 2015
Aceptado: 15 de septiembre de 2015
Dra.C. Gabriela F. Rocha, Laboratorio de Química Biológica, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Argentina. Email: grocha@unlu.edu.ar
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