Artículos Originales

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Neuropatía epidémica cubana. Parte I. Aislamiento viral

Dr. PEDRO MAS LAGO<1 Lic. JOSE L. PELEGRINO,<2 Dra. MARIA G. GUZMAN,<1 Dra. VIRGINIA CAPO,<3 Dra. LICEL RODRIGUEZ,<4 Dra. PILAR RODRIGUEZ<5 y Dr. GUSTAVO KOURI<1
 

RESUMEN

Desde finales de 1991 hasta junio de 1993 se produjo la epidemia de neuropatía que afectó a 50 963 personas. Se presentaron 2 formas clínicas de la enfermedad: la forma óptica (con o sin manifestaciones periféricas, 52 % de los casos) y la periférica (48 %). Los estudios epidemiológicos pusieron de manifiesto trastornos nutricionales, fundamentalmente déficit de vitaminas del complejo B dados por las dificultades económicas del país en el "período especial". Se identificaron el hábito de fumar y la ingestión de bebidas alcohólicas como factores de riesgo, en particular para las formas más severas de la enfermedad. En los estudios virológicos de líquido cefalorraquídeo (LCR) se obtuvo aislamiento en células Vero de virus Coxsackie A9 en el 4 % y de otro agente de efecto citopatogénico ligero en el 80 % de las muestras. El 67 % de las muestras de LCR inoculadas en ratones lactantes produjo enfermedad o muerte de los animales. Se comprobó la persistencia viral en el LCR por un tiempo de al menos 21 días en un grupo de pacientes y de 1 año en otro.

Palabras clave: NEURITIS OPTICA/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; TRASTORNOS NUTRICIONALES; DEFICIENCIA DE VITAMINA B; CONSUMO DE BEBIDAS ALCOHOLICAS; TABAQUISMO; VIRUS COXSACKIE A/ /aislamiento de purificación; CELULAS VERO.

INTRODUCCION

A finales de 1991, en la parte más occidental del país, se inició un incremento en el número de pacientes con neuritis óptica. A finales de 1992 el total de casos reportados era de 472, y se encontraban afectadas otras provincias. Los pacientes presentaban déficit visual bilateral con dificultad a la percepción de colores en el eje rojo-verde y escotoma simétrico bilateral central o cecocentral. La epidemia tuvo su pico máximo en los primeros meses de 1993, declinando en forma abrupta en el mes de mayo, lo que coincide con la distribución gratuita de un suplemento de vitaminas del complejo B a toda la población.

Se pudieron caracterizar 2 formas clínicas de la enfermedad: una con síntomas predominantemente ópticos y la otra con predominio de sintomatología periférica, dados por parestesias, alteraciones de la sensibilidad y los reflejos, fundamentalmente en los miembros inferiores. En gran número de casos se presentaban síntomas de ambas formas clínicas. Otros síntomas eran hipoacusia, disfonía, disfagia y pérdida de peso corporal. A partir de mayo el reporte de casos se mantuvo bajo, con un total de 50 963 el 30 de junio, de los cuales el 52 % era de la forma óptica (con o sin manifestaciones periféricas) y el 48 % de la forma periférica.

Los estudios toxicológicos y nutricionales han mostrado que la enfermedad está relacionada con una disminución de la ingestión de nutrientes, fundamentalmente vitaminas del complejo B, a que se ha visto sometida la población producto de las dificultades económicas derivadas del bloqueo que han llevado al país al "período especial" desde 1990. El hábito de fumar y la ingestión de bebidas alcohólicas se han identificado como factores de riesgo adicionales, en particular en los casos severos.1,2

MATERIAL Y METODO

Muestras. Se obtuvieron 125 muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes ingresados en el Centro de Investigaciones Médico-Quirúrgicas (CIMEQ) y en el Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras" y que cumplían con la definición de caso establecida por un grupo de expertos para la neuropatía epidémica. Entre los pacientes seleccionados existían ambas formas clínicas de la enfermedad y eran procedentes de las regiones occidentales, central y oriental del país. Los LCR eran congelados y transportados de esta forma al laboratorio, donde eran inoculados inmediatamente o mantenidos a -70 oC hasta ser procesados.

Controles. Como controles para el aislamiento viral se obtuvieron 30 LCR de pacientes quirúrgicos que recibieron anestesia raquídea o se les realizó punción lumbar con otros fines diagnósticos. Estos pacientes no mostraban síntomas de neuropatía al momento de realizarles la punción. Las muestras de LCR eran conservadas y transportadas como se explicó anteriormente.

Aislamiento en cultivos celulares. Para el aislamiento viral se siguió la metodología recomendada en el capítulo de "Enterovirus" del Diagnostic Procedure.3 Los primeros 10 LCR fueron inoculados en 12 líneas celulares distintas (tabla 1). El resto (115) fue inoculado en células Vero por ser el sistema celular en que se obtuvo mejor resultado. Se utilizaron medios Parker 199, Minimum Esencial Eagle y Dulbecco modificado suplementados con suero de ternero fetal (STF) según los requerimientos de las diferentes líneas celulares. El medio de mantenimiento de las células Vero fue Parker 199 que contenía 2 % de STF y 0,1-0,2 % de bicarbonato de sodio. Las células se inocularon con 0,1 mL de LCR y fueron incubadas a 37 oC por lo menos 5 a 6 días (XL-2 y C636 fueron incubadas a 30 oC). Se dieron 3 pases después de congelar y descongelar antes de dar el resultado como negativo. 

TABLA 1. Cultivo celulares utilizados para el aislamiento de virus en la neuropatía epidémica

* Se usaron células Vero de 2 pases distintos (ATCC).

Fuente: IPK.

Inoculación en ratones lactantes. Aislamientos de cultivos de tejidos y muestras de LCR se inocularon por vía intracerebral e intraperitoneal en ratones lactantes Balb/C o albinos blancos suizos de 1 día de nacidos utilizando una camada (6 a 10 ratones) por muestra. Se realizó observación diaria durante 1 mes. Los animales que mostraron síntomas fueron sacrificados para estudios histopatológicos, haciéndoles una incisión anteroposterior dorsal y ventral fijándolos en formol al 5 %.

Examen histopatológico de ratones. Diferentes órganos y tejidos de los animales fijados en formol fueron procesados automáticamente en equipo "Histokinette" para ser incluidos en bloques de parafina. Se prepararon cortes en láminas portaobjeto que fueron coloreadas con hemmatoxilina-eosina.4

Identificación de los aislamientos. Se realizó por prueba de microneutralización utilizando 100 TCD50 de virus en 0,025 mL e igual volumen de los pools de antisueros a Enterovirus de Lim-Benyesh-Melnick (LBM)5 recibidos de la OMS. El contacto virus-suero fue de 4 horas a 37 oC en atmósfera de CO2 al 5 %. Se utilizó 0,05 mL de suspensión de células Vero en concentración de 150 000 células/mL. También se realizó prueba de neutralización con suero hiperinmune al virus de Inoue-Melnick tipo 2 donado gentilmente por el doctor Michio Ito del Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, New York.
 

RESULTADOS

Las primeras 10 muestras de LCR inoculadas en 12 líneas celulares produjeron efecto citopatogénico (ECP) en células Vero. Dos de esas muestras también produjeron ECP en células RD. No se observó ECP en las otras líneas celulares utilizadas, por lo cual el resto de los LCR (115) se inocularon sólo en células Vero.

En total se obtuvo ECP en 105/125 (84 %) de los LCR. Se observaron 2 tipos de ECP: uno típico de Enterovirus obtenido en 5 muestras y otro, presente en 100 muestras, era ligero, de aparición tardía (5 a 6 días) y más evidente en los bordes del cultivo celular en los primeros pases (ECP-L). En los pases sucesivos este ECP-L se hacía más evidente, pero siempre era de aparición tardía y no afectaba toda la capa celular.

Los 5 aislamientos con ECP típico de Entero- virus fueron identificados como Coxsackie A9 (CA9) por prueba de neutralización con los pools de LBM. Tres de las cepas con ECP-L no pudieron ser identificadas por dichos pools ni tampoco fueron neutralizadas con el antisuero de Inoue-Melnick tipo 2. Una cepa de ECP-L (44/93 IPK) fue identificada como CA9 en el Laboratorio Virológico Regional de Glasglow, Reino Unido.

De las muestras controles se obtuvieron 2 aislamientos de ECP-L (6,7 %, p < 0,01).

INOCULACION EN RATONES LACTANTES

El 67 % de los LCR de pacientes con neuropatía epidémica produjeron enfermedad o muerte en los ratones lactantes inoculados directamente por vía intracerebral e intraperitoneal (tabla 2). Una cepa de ECP-L (44/93 IPK) y otra con ECP típico de Enterovirus e identificada como CA9 (47/93 IPK), aisladas en células Vero, produjeron en los ratones síntomas similares a lo observado con los LCR cuando fueron inoculadas. El período de incubación osciló entre 4 y 30 días. Los síntomas variaron, desde parálisis flácida completa de los miembros posteriores a lateralismo, piloerección y alopecia en la región nasal. Con algunas muestras no enfermaron todos los animales de la camada. Otros animales que presentaron incoordinación y piloerección se recuperaron posteriormente.

TABLA 2. Inoculacion de LCR de pacientes con neuropatía epidémica en ratones lactantes

* Muertos o enfermos.

Fuente: IPK.

p < 0,01.

En el examen histopatológico de los animales enfermos se pudieron constatar lesiones de órganos y tejidos tales como: degeneración hialina, encefalitis, lesión de la mucosa intestinal, etcétera (tabla 3).

TABLA 3. Hallazgos histopatológicos en ratones

En 25 pacientes de los cuales se había logrado aislamiento se obtuvo una segunda muestra de LCR 21 a 30 días después de la primera y en 1 caso 1 año después. En 24 de las 25 segundas muestras (96,0 %) se obtuvo ECP-L en células Vero. En 1 de estos pacientes el primer aislamiento había dado ECP típico de Enterovirus e identificado como CA9. El paciente del cual se obtuvo reaislamiento al año había tenido una evolución clínica desfavorable durante ese período.
 

DISCUSION

Las epidemias de neuromielopatías tropicales han sido descritas en las regiones ecuatoriales del mundo desde hace muchos años. Se considera que este grupo de enfermedades neurológicas tiene una causa multifactorial.6 Además de la malnutrición y el sprue tropical, ciertos agentes neurotóxicos tales como el tabaco, el alcohol etílico y metílico, el arsénico, metales pesados, pesticidas y drogas han sido relacionados como agentes causales.7

Con excepción de los síntomas abdominales, el cuadro clínico y algunas características epidemiológicas de la neuropatía epidémica en Cuba fueron similares a la neuropatía mielo óptica subaguda (SMON) descrita en Japón en 1971.8 Durante la epidemia japonesa, se aisló del LCR en el 80 % de los pacientes un agente de ECP muy ligero llamado virus del SMON, actualmente conocido como virus Inoue-Melnick.9 También fueron aislados algunos Enterovirus en dicha epidemia.10-12 Aunque un medicamento antidiarreico llamado Clioquinol fue considerado por algunos el agente causal,13 nunca fue completamente descartado el papel del virus Inoue-Melnick en la causa de la enfermedad.

El porcentaje de positividad obtenido por nosotros es similar al reportado por Inoue en la epidemia de Japón. Sin embargo, entre nuestros aislamientos existen 5 con ECP típico de Enterovirus y los ECP-L parecen corresponder a un agente distinto ya que no fueron neutralizados por el suero específico.

El tanto por ciento de positividad en ratones lactantes (67 %) también es alto, y por otro lado las lesiones histopatológicas en los animales enfermos, incluso en los casos que en el cultivo celular se obtuvo ECP-L, son compatibles con las producidas por Enterovirus del grupo Coxsackie A.

El hecho de haberse obtenido una diferencia significativa en los tantos por cientos de positividad entre las muestras de LCR de los enfermos y los controles, así como obtener aislamiento en 2 sistemas independientes (células Vero y ratones lactantes), constituyen fuertes argumentos para plantear que los agentes aislados proceden de las muestras de LCR y no que sean virus contaminantes del sistema celular o producto de otro error del trabajo, a pesar de no haber en la literatura antecedentes de aislamientos de Enterovirus en estas enfermedades y no encontrarse infiltrado inflamatorio en las biopsias de nervio sural efectuadas en los pacientes. Como confirmación adicional de lo expuesto anteriormente obtuvimos el reaislamiento en una línea de células Vero recientemente adquirida de la American Tissue Culture Collection y con sólo 3 pases en el departamento de cultivo de tejidos de nuestro Instituto.

El virus de Inoue-Melnick ha sido aislado del LCR de pacientes con esclerosis múltiple por períodos de hasta 5 meses.14 La persistencia de Enterovirus en el LCR se ha comprobado en pacientes agammaglobulinémicos con meningoencefalitis crónica.15 El agente de ECP-L fue aislado en algunos pacientes hasta 30 días después del primer aislamiento y en 1 caso después de 1 año. La persistencia de estos agentes en el LCR sugiere que ellos pueden ser importantes en los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad.

Los resultados de los estudios epidemiológicos realizados no apoyan el carácter contagioso de la enfermedad. El número tan bajo de pacientes menores de 15 años reportado en la población tampoco se corresponde con la epidemiología de los Enterovirus. Como hipótesis que pueda explicar esta aparente contradicción pudiera plantearse que en las infecciones primarias por Enterovirus producidas fundamentalmente en la infancia queden genomas o parte de éstos en el sistema nervioso central de forma latente, los cuales posteriormente podían ser activados por factores tóxicos y/o nutricionales. Esto, que ya fue planteado para el virus de la encefalomielitis equina por Noran y Baker en 1945, también podía ser el mecanismo para explicar la presencia de antígenos que inducen la formación de anticuerpos a Enterovirus en inmunocomplejos circulantes de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica.16

AGRADECIMIENTO

Queremos expresar nuestro reconocimiento a la excelente asistencia técnica de Rosa Palomera. También a la UNESCO por haber colaborado en parte al financiamiento de este trabajo (Contrato No.883579.3).

<1Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).

<2Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Agregado. IPK.

<3Especialista de II Grado en Anatomía Patológica. Investigadora Titular. IPK.

<4Especialista de I Grado Microbiología. IPK.

<5Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Agregado. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología.
 

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Llanos G, Asher D, Brown P, Gajdusek DC, Muzi-Mendoza R, Marquez M,et al. Epidemic neuropathy in Cuba. Epidemiol Bull 1993;14(2):1-4.
2. Más Lago P, Rodríguez MP, Guzmán MG, Alvarez M, Muzio V, Ancheta O, et al. Resultados preliminares de laboratorio virológico en estudio de casos de neuropatía epidémica cubana. Bol Epidemiol IPK 1993;1(Esp):7-8.
3. Melnick JL, Schmidt NJ, eds. Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections. Washington: American Public Health Association, 1979:471-534.
4. Roberts GBS, Boyd JB. The histopatology of Enterovirus infection of new-born mice. J Infect 1987;15:45-6.
5. Lim KA, Benyesh-Melnick M. Typing of viruses by combinations of antiserum pools: application to typing of enteroviruses (Coxsackie and ECHO). J Immunol 1960;84:309-17.
6. Roman GC, Spencer PS, Schoenberg BS. Tropical myeloneuropa- thies: the hidden endemias. Neurology 1985;35:1158-70.
7. Senanayake N, Román GC. Toxic neuropathies in the tropics. J Trop Georgr Neurol 1991;1:3-15.
8. Sobue I, Ando K, Iida M, Takayanagi T, Yamamura Y, Matsuoka Y. Myeloneuropathy with abdominal disorders in Japan: a clinical study of 752 cases. Neurology 1971;21:168-73.
9. Inoue YK, Nishibe Y, Nakamura Y. Virus associated with SMON in Japan. Lancet 1971; 1:853-4.
10. Shingu M, Nalawama Y, Takedatse H, Okuda K. Isolation of ECHO type 21 virus from patients with "infections column myelitis", a myelitis following abdominal signs (Japan). J Ass Inf Dis 1965;89:139-44.
11. Miyahara M, Iimura O, Tamura T, Hoshikawa M, Senda A, Nishiya A. A case of so-called "subacute myelo-optico-neuro pathy" (SMON) from which Coxsackie type A4 was isolated. J Jap Soc Int Med 1968;57:1113-7.
12. Nakazawa T, Tsurumizu T, Kmo Y, Yoshiba K, Maruyama M. Experimental pathology of virus infection established from the subacute myelo-optico-neuropathy following abdominal signs. Adv Neurol Sci 1970;14:266-73.
13. Meade TW. Subacute myelo-optic-neuropathy and Clioquinol: an epidemiological case-history for diagnosis. Brit J Prev Soc Med 1975;29:157-69.
14. Melnick JL, Seidel E, Wang SS, Muchinik G, Rashti EJ, Jacobs LD, et al. Persistence of Inoue-Melnick virus and antibody in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1985;22:651-3.
15. MacKinney RE, Jr, Catz SL, Wilfert CM. Chronic enteroviral meningoencephalitis in agammaglobulinemic patients. Rev Infect Dis 1987;9:334-56.
16. Bartfeld H, Dham Ch, Donnenfeld H, Ollar RA, Masi MT de, Kascsak R. Enteroviral-related antigen in circulating immune complexes of amyotrophic lateral sclerosis patients. Intervirology 1989;30:202-12.

Recibido: 30 de septiembre de 1994. Aprobado: 3 de noviembre de 1994.

Dr. Pedro Más Lago. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.