Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Dr. PEDRO MAS LAGO,<1 Dra. MARIA G. GUZMAN,1 Dra. VIRGINIA CAPO,<2 Lic. MAYLING ALVAREZ,<3 Dra. SONIA RESIK,<4 Dr. ANGEL GOYENECHEA<5 y Dr. GUSTAVO KOURI1
Se presentan resultados que permiten plantear la existencia de relaciones antigénicas entre los virus aislados del líquido cefalorraquídeo de pacientes con neuropatía epidémica y estructuras del sistema nervioso central humano. Estas evidencias se han obtenido por 2 vías distintas e independientes: 1) por método de doble difusión en agarosa, inmunoblot e inmunohistoquímicos, comprobándose que los anticuerpos inducidos por los virus aislados reaccionan con antígenos del sistema nervioso central y periférico, 2) el suero obtenido por inmunización de un conejo con extracto de cerebro humano neutraliza los mismos virus que los neutralizados por los sueros hiperinmunes obtenidos con los aislamientos. Se discute la posible participación de los virus como mediadores de un proceso autoinmune en la etiopatogenia de la enfermedad.
Palabras clave: NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; NEURITIS/etiología; EFECTO CITOPATOGENICO VIRAL; VIRUS COXSACKIE/A aislamiento & purificación; VIRUS COXSACKIE B/aislamiento & purificación; TEST DE NEUTRALIZACION/métodos; WESTERN BLOTTING/métodos.
En el curso de la neuropatía epidémica ocurrida en Cuba en 1992/1993 se aislaron del líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes, agentes virales que mostraron 2 tipos de efecto citopatogénico (ECP): uno típico de Enterovirus y otro mucho más ligero (ECP-L), que han sido previamente descritos.1,2 Los trabajos por inmunoblot y pruebas de neutraliza ción cruzada mostraron que los agentes productores de los 2 tipos de ECP están relacionados antigénica mente con el virus del grupo Coxsackie.3 En los estudios serológicos con sueros de pacientes y controles sanos se comprobó un perfil inmunitario compatible con las características antigénicas de los Enterovirus aislados, mientras que para los agentes de ECP-L se puso de manifiesto una pérdida de anticuerpos, lo cual hizo pensar en un posible consumo interno de éstos.4 Teniendo en consideración que el cuadro clínico de los pacientes está dado por síntomas que expresan daños del sistema nervioso central y/o periférico, sin signos inflamatorios, nos propusimos investigar las posibles relaciones antigénicas de los virus aislados con estructuras de este sistema, lo cual permitiría considerar una posible explicación de la participación de éstos en la etiopatogenia de la enfermedad, como mediadores de un proceso autoinmune. El objetivo de este trabajo es presentar los resultados obtenidos hasta el presente en la investigación de dichas relaciones antigénicas y discutir su posible participación en la enfermedad.
Virus. Se utilizaron las cepas: 47/93 IPK identificada como Coxsackie A9 (CA9), 44/93 IPK, M26-IG y M28-IG, estas 3 últimas de ECP-L y todas aisladas del LCR de pacientes con neuropatía epidémica, así como la fracción 11 (F11) obtenida de un gradiente de densidad en sacarosa de la cepa M26-IG que mostró ECP típico de Enterovirus. También fueron utilizadas las cepas de referencia de CA9, Coxsackie B1-6 (CB1-6) recibidas del Instituto de Poliomielitis y Virus de Encefalitis de Moscú, Rusia y los Poliovirus 1, 2 y 3 (P1, 2, 3 cepas Sabin) recibidas del National Institute for Biological Standards and Control de Inglaterra.
Pruebas de neutralización. Se realizaron como se ha explicado anteriormente.4
Muestras del sistema nervioso central humano. Se obtuvieron 8 nervios olfatorios y fragmentos de cerebro de 9 personas fallecidas por accidentes, en las cuales se practicó necropsia médico-legal y que los familiares refirieron no habían padecido neuropa tía epidémica. Los nervios y fragmentos de cerebro fueron macerados con PBS pH 7,2 para obtener una suspensión al 25 % aproximadamente. Se centrifugó a 12 000 r.p.m. durante 20 minutos y el sobrenadante fue utilizado como antígeno para inmunizar conejos y en prueba de doble difusión en agarosa según método de Ouchterlony descrito en el Manual de Métodos Inmunodiagnósticos.5
Obtención de suero hiperinmune anticerebro humano. El antígeno para inmunizar conejos blancos Nueva Zelandia fue el obtenido con fragmentos de cerebro como fue descrito anteriormente. El esquema de inmunización consistió en una primera dosis intraperitoneal y 4 intravenosas de 5 mL cada una en los días 0, 7, 21, 55 y 85. Se realizó sangramiento 7 días después de la quinta inyección.
]]> Prueba inmunohistoquímica en biopsias de nervio sural. Se seleccionaron cortes de biopsias de nervio sural de pacientes con neuropatía epidémica para aplicar la técnica de peroxidasa antiperoxidasa (PAP)6 y la técnica de AuBio (CIGB).Prueba de Western blot. Se utilizaron antígenos de la cepa M26-IG preparados según método descrito por Gold et al. para Herpesvirus,7 y de cerebro humano preparado como fue descrito previamente y suero hiperinmune obtenido en conejo a las cepas 44/93 IPK y M28-IG. La marcha técnica fue la misma descrita anteriormente.3
En la prueba de doble difusión en agarosa el suero anti-M28-IG produce bandas de precipitación con los antígenos preparados con los 8 nervios olfatorios procedentes de distintas personas. No se obtuvo bandas con los sueros hiperinmunes a células Vero, y los virus CB3, P1, Echo 6 y 47/93 IPK (CA9) (figura 1). Este suero no produjo bandas de precipitación con antígenos obtenidos con cerebros de ratón, curiel y conejo (datos no presentados).
Por la prueba de inmunoblot los sueros hiperinmu nes a las cepas 44/93 IPK y M28-IG dan señales con los antígenos preparados con la cepa M26-IG y el cerebro humano. Los antígenos detectados en ambos casos tienen un peso molecular alrededor de 40 000 a pesar de que no se encuentran exactamente al mismo nivel, ocupando el del cerebro una posición ligeramente más avanzada que el del virus en la corrida electroforética. Esto no está en contra de una identidad antigénica, pues epitopes iguales pueden corresponder a moléculas de distinto peso.
El suero hiperinmune a la cepa 44/93 IPK recono ció estructuras nerviosas en 7 biopsias de nervio sural de pacientes con neuropatía epidémica por las técnicas de inmunoperoxidasa y AuBio (figura 2). En 3 de las biopsias se obtuvo una señal ligera con el suero antipolio 1, y resultaron todas negativas con los sueros hiperinmunes a los virus Echo 1 (figura 3) e Influenza A.
En la tabla se presentan los resultados por prueba de neutralización del suero hiperinmune a cerebro humano y el obtenido a cepas de virus aisladas del LCR de pacientes con neuropatía frente a distintos Enterovirus. Existe una correlación que va desde r=0,837 al comparar los anticuerpos neutralizantes a los virus probados en el suero anticerebro y los de las cepas 44/93 IPK y M28-IG hasta r=0,975 con los sueros a las cepas 47/93 IPK y F11, todas estas correlaciones tienen una significación superior a p < 0,01.
Es de señalar que tanto el suero anti-F11 como el anticerebro muestran actividad neutralizante en títulos bajos cuando se enfrentan al virus CB2. Esto se corresponde con un título promedio geométrico más elevado y un mayor tanto por ciento de sueros con anticuerpos neutralizantes a este virus en los enfermos que el grupo control3 e interpretado anteriormente como debido a una respuesta anamnésica.
Hallazgos clínicos y experimentales sugieren que factores humorales tales como anticuerpos contra los nervios periféricos y las citoquinas, pudieran estar implicados en la inmunopatogenia del síndrome de Guillain Barré (SGB) y de la polirradiculoneuropatía inflamatoria crónica desmielinizante. Infecciones microbianas capaces de producir una respuesta inmune que tenga reacción cruzada con constituyentes nerviosos, se mantiene como la hipótesis de trabajo más plausible en la etiopatogenia del SGB y de otros cuadros neurológicos crónicos; en este sentido se dirigen muchas investigaciones actuales.8,9 Distintos agentes biológicos son estudiados como posibles mediadores de procesos autoinmunes en estas enfermedades.
A partir de cultivos de Campylobacter jejuni, aislados de pacientes con SGB, se han obtenido oligosacáridos que tienen una alta homología con gangliósidos.10 Infecciones por Yersinia enterocolitica han sido asociadas con procesos neurológicos centrales y periféricos de evolución tórpida y en ocasiones con secuelas persistentes.11
La gran variedad de gangliósidos con especificidad antigénica y su desigual distribución en diferentes estructuras del sistema nervioso12 permitiría explicar las individualidades clínicas de procesos que tienen un mecanismo etiopatogénico de autoinmunidad.
]]> Los resultados expuestos obtenidos por diferentes métodos coinciden en sugerir que pudiera existir una relación antigénica entre los agentes virales aislados de pacientes con neuropatía epidémica, fundamental mente los de ECP-L, y estructuras del sistema nervioso central y periférico humano. La alta correlación existente entre los anticuerpos inducidos por distintas cepas de los virus aislados y los producidos por los antígenos del cerebro al ser probados por neutralización coincide con lo expresa do anteriormente. Es conocida la gran homología existente en la secuencia aminoacídica de la proteína VpG de algunos virus Coxsackie y de la proteína básica de la mielina.13 La acción neutralizante del suero anticerebro la consideramos específica basado en: 1) corresponder a los mismos virus que son neutralizados con los sueros a las cepas aisladas y mostrar que los anticuerpos que ellos inducen reaccionan con el sistema nervioso, lo que se ha demostrado utilizando diferentes métodos y 2) si la neutralización fuera debida a una reacción inespecífi ca no se explicaría su especificidad para algunos tipos de los Enterovirus probados ni tampoco la diferencia en título a éstos.Por otro lado, la menor prevalencia de anticuerpos a los agentes de ECP-L en los enfermos que en los controles4 podría ser resultado de un consumo en el interior del organismo de éstos y explicar la participación de los virus como mediadores de un proceso autoinmune. La persistencia (hasta de 1 año) de los agentes infecciosos2 en los pacientes que han evolucionado desfavorablemente mantendría un estímulo antigénico que perpetuaría la autoinmuni dad. Lo antes expuesto no excluye la participación de factores tóxico-nutricionales que pueden haber coadyuvado al inicio del cuadro clínico incrementan do la virulencia del agente infeccioso o, lo que es más probable, favoreciendo los mecanismos por los cuales los agentes virales producen el daño celular. Experimentalmente se ha demostrado que la patogenicidad de los virus Coxsackie puede estar relacionada con los estados nutricionales, específica mente bajos niveles de selenio (presente en la población enferma) y de vitamina E.14,15
La falta de una reacción inflamatoria observada en las biopsias de nervio sural de los pacientes, no constituye por sí sola un argumento para excluir la participación de virus en la etiopatogenia de la enfermedad. La apoptosis (muerte celular programa da) transcurre normalmente en el organismo sin reacción inflamatoria. Los mecanismos de regulación de la apoptosis pueden ser alterados por virus o los productos formados como consecuencia de la infección. Se conocen distintos virus que pueden producir daño celular in vivo y/o in vitro por un mecanismo de apoptosis.16-18 También es conocido que las deficiencias en selenio estimulan el incremen to del fenómeno de la apoptosis, mientras que hormonas como la prolactina y el beta-estradiol lo inhiben. El incremento hasta de 60 veces de la concentración de esta última durante la gestación, también podría explicar la no ocurrencia de la enfermedad en gestantes, si la apoptosis fuera la vía por la cual el virus interviene en la etiopatogenia de la enfermedad.
La necesidad de la concurrencia de distintos factores para que se produzca la enfermedad hace que ésta no presente el patrón clásico de una enfermedad infecciosa.
En conclusión, consideramos que los resultados expuestos unidos al cúmulo de conocimientos existentes deben abrir nuevas investigaciones que permitan dar una explicación integral, multifactorial, a la causa de la neuropatía epidémica cubana.
Queremos expresar nuestro agradecimiento al profesor Israel Borrajero del Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras" por facilitarnos las biopsias de nervios sural. A la doctora Carmen Más del Instituto de Medicina Legal por las muestras de tejido nervioso humano. A la doctora Alina Llop por la revisión del manuscrito. A Rosa Palomera por su excelente asistencia técnica. A la UNESCO por haber, en parte, colaborado al financiamiento de esta investigación (Contrato No.883579.3).
<1Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular.
<2Especialista de II Grado en Anatomía Patológica. Investigadora Titular.
<3Licenciada en Microbiología.
<4Especialista de I Grado en Microbiología.
]]> <5Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular.Recibido: 19 de diciembre de 1994. Aprobado: 10 de enero de 1995.
Dr. Pedro Más Lago. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
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