Centro Colaborador de la OPS/OMS para el estudio de las enfermedades víricas. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Lic. ROSMARI RODRIGUEZ,<1 Dra. MARIA G. GUZMAN,<2 Dra. SONIA RESIK,<3 Lic. MAYLING ALVAREZ,<4 Lic. LUIS MORIER,<5 Lic. AIDA CASTILLO<6 y Dr. PEDRO MAS2
En el presente reporte se presentan las condiciones necesarias para el desarrollo de placas en los agentes productores de efecto citopático ligero que fueron aislados de muestras de líquido cefalorraquídeo de pacientes con neuropatía epidémica.
Palabras clave: NEURITIS/líquido cefalorraquídeo; EFECTO CITOPATOGENICO VIRAL; CELULAS VERO.
La titulación viral mediante la técnica de placas se considera en virología un método altamente cuantitativo y preciso para el análisis de la infectividad viral. Permite estudiar en forma segura la capacidad neutralizante de agentes antivirales y de anticuerpos, y posibilita la purificación de un agente a partir del clonaje de sus placas.1
Considerando la dificultad en la visualización del efecto citopático (ECP) producido por algunos de los agentes aislados a partir de muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR) de pacientes con neuropatía epidémica (NE), decidimos estandarizar el método de placas para dichos agentes con el objetivo de aplicarlo en la caracterización antigénica y físico-química de éstos.2
En el presente trabajo se reportan las condiciones óptimas para el desarrollo de la titulación viral y de la neutralización por placas para los agentes productores de ECP ligero (ECP-L).2
Cultivos celulares. Se utilizaron cultivos de células Vero (ATCC) crecidas en medio 199 con suero de ternero fetal al 10 % y cultivos de células BHK21 crecidas en medio MEM con igual concentración de suero.
]]> Virus. Para los estudios se utilizaron las cepas M26 CIGB aisladas en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología a partir del LCR de un paciente con NE y productoras de un ECP-L, las que contaban en el momento del estudio con 8 pases en células Vero; la cepa 44/93 IPK con el mismo tipo de ECP y que contaba en ese momento con 2 pases en MDCK y 3 pases en células Vero; y la cepa F11 (IPK) obtenida a partir de la purificación de la M26 CIGB contando en el momento del estudio con 2 pases en células Vero.3TECNICA DE PLACAS
Células BHK21. Para el desarrollo de la técnica se siguió el método descrito por Morens et al.4 con ligeras modificaciones. Placas plásticas de 24 pozuelos fueron sembradas con una suspensión de células en medio MEM conteniendo suero de ternero fetal al 10 % y a una concentración de 3x105 células/mL, a razón de 0,5 mL por pozuelo. Después de 1 hora en reposo a temperatura ambiente, se realizó la inoculación viral con 50 mL por pozuelo de diluciones seriadas en base 10. Después de 24 horas de incubación a 37 oC en atmósfera de 5 % de CO2 se agregó 0,5 mL por pozuelo de medio MEM 2x conteniendo suero de ternero al 10 %, glutamina y carboximetilcelulosa al 1,5 %. Las células inoculadas fueron mantenidas a 37 oC en atmósfera de 5 % de CO2 hasta el momento de la tinción con naftol blue-black.
Células Vero. Similar a lo descrito en el párrafo anterior, se sembraron placas plásticas con una suspensión de células Vero en medio 199 con suero de ternero fetal al 10 % y a una concentración de 2x105 células/mL. La inoculación y el procesamiento posterior fueron similares al anteriormente descrito con la diferencia de que el segundo medio estuvo constituido por medio 199 2x en lugar de medio MEM.
Otra variante utilizada fue la siembra en frascos plásticos de 25 cm2 de células Vero suspendidas en medio 199 con suero de ternero fetal al 10 % y una concentración de NaHCO3 de 1,2 g/L. Cada frasco fue inoculado inmediatamente a la siembra celular con 0,5 mL de las diluciones seriadas en base 10 de la cepa viral. Después de 24 horas de incubación a 37 oC se añadió la segunda capa de medio constituida por 199 2x conteniendo suero de ternero fetal al 10 % e igual concentra ción de NaHCO3 y carboximetilcelulosa al 1,5 %. Los cultivos fueron mantenidos a 37 oC hasta el momento de la tinción la que se efectuó en la forma descrita anteriormente.
TECNICA DE NEUTRALIZACION POR REDUCCION DE PLACAS
Para la realización de la técnica de neutralización, se mezclaron volúmenes iguales de virus (80 UFP/0,5 mL) y de antisuero a una dilución de 1/10. En el ensayo se probó un suero hiperinmune preparado en conejo contra la cepa M28 CIGB (590) productora de ECP-L y aislada a partir del LCR de un paciente con NE.5
Después de 4 horas de incubación a 37 oC cada mezcla se inoculó en botellas plásticas de 25 cm2 sembradas con células Vero. El resto del procesamiento se realizó como se describió anteriormente para la variante de células Vero sembradas en frascos plásticos.
Tanto con el empleo de las células BHK21 como con las Vero crecidas en placas plásticas de 24 pozuelos no se lograron las condiciones óptimas para la observación de placas de los agentes estudiados.
Con las células Vero crecidas en frascos plásticos el comportamiento fue diferente, se observaron placas con las 2 cepas estudiadas.
]]> Consideramos que 2 condiciones influyeron en la no obtención de las placas en la primera variante. Por una parte en las células BHK21 se observó un sobrecrecimiento celular que no permitió la observación del daño producido por el virus debido a la presencia de varias capas celulares, y por otra, en ambas líneas celulares el pH ácido del medio no permitió el crecimiento viral. En trabajos previos se reportó la sensibilidad de los agentes productores del ECP-L frente a pH bajos.6 Al crecer las células en frascos plásticos con una mayor concentración de NaHCO3 y donde no existía intercambio gaseoso se logró la observación de las placas.La cepa M26 CIGB productora de ECP-L desarrolló placas de 1 mm aproximadamente de diámetro y forma de "punta de alfiler" al noveno día de posinoculación. Para la cepa F11/94 IPK se observaron placas de un tamaño de 2 mm de diámetro y de bordes irregulares al cuarto día de posinoculación, se apreciaron algunas placas aisladas similares a las observadas con la cepa 589. En la figura se presentan las placas obtenidas con ambas cepas (M26 y F11). La cepa 44/93 IPK mostró placas de morfología similar a las de la cepa M26 CIGB.
Durante los estudios con las cepas productoras de ECP-L se evidenció la aparente presencia de 2 agentes virales o 2 variantes de un mismo virus. En un trabajo previo se reportó el hallazgo de un agente productor de ECP-L en una cepa de Coxsackie A9 (47/93 IPK) aislada de un paciente con NE y de un virus con características similares a los Enterovirus (F11/94 IPK) durante la purificación de una cepa de ECP-L (M26 CIGB).3
Los resultados obtenidos al realizar la técnica de placas con ambas cepas (M26 CIGB y la F11 aislada durante la purificación de la anterior) indican que al igual que se diferencian en sus características culturales y de sensibilidad frente a varios agentes físicos y químicos,3 sus placas son también diferentes en tamaño, morfología y momento de aparición, lo que sugiere que ambos agentes tienen características distintas. La observación de placas que recuerdan a las observadas con la cepa M26 CIGB en la F11 pudiera indicar que este último no ha sido completamente purificado aunque no podemos descartar la presencia de placas satélites.
Ambos virus, M26 CIGB y F11, fueron neutralizados en el 100 % por el suero hiperinmu ne preparado en conejos a la cepa M28 CIGB, lo que demuestra que existe comunidad antigénica entre la cepa M28 CIGB (productora de ECP-L) y las cepas estudiadas en nuestro trabajo.
La estandarización del método de placas para estos agentes nos permitirá intentar el clonaje de éstos y profundizar en su estudio.
Queremos expresar nuestro agradecimiento a la UNESCO por haber financiado parte de la presente investigación (Proyecto No.883579.3).
<1Licenciada en Radioquímica.
<2Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología. Profesor e Investigador Titular.
<3Especialista de I Grado en Microbiología. ]]>
Lic. Rosmari Rodríguez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.