0375-0760 0375-0760 S0375-07601995000200008 Cuba 00 12 1995 00 12 1995 47 2 118 121

Evaluación de antígenos y antisueros para su utilización en el serodiagnóstico de aspergilosis

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Evaluación de antígenos y antisueros para su utilización en el serodiagnóstico de aspergilosis

Lic. CARLOS M. FERNANDEZ ANDREU,1 Lic. FERNANDO TRAVIESO RUIZ,2 Dr. GERARDO MARTINEZ MACHIN3 y Lic. MAYDA PERURENA LANCHA4

RESUMEN

La aspergilosis se ha convertido en los últimos años en una importante micosis oportunista, con una gran variedad de manifesta ciones clínicas. Como forma de contribuir al completamiento del diagnóstico serológico de esta micosis, fueron preparados los reactivos biológicos (antígenos y antisueros) a partir de cepas de las especies Aspergillus niger, Aspergillus flavus y Aspergillus terreus con vistas a su utilización en pruebas de inmunoprecipitación. Los reactivos fueron evaluados por inmunodifusión doble frente a un sistema comercial de referencia, se obtuvieron resultados satisfactorios, lo que garantiza la ampliación del diagnóstico serológico de la aspergilosis en el Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), con un importante ahorro de importaciones.

Palabras clave: ASPERGILOSIS/diagnóstico; SERODIAGNOSTICO; ASPERGILLUS/aislamiento y purificación.

INTRODUCCION

El diagnóstico de laboratorio de la aspergilosis requiere de exámenes microscópicos, cultivo e identificación del agente causal, exámenes histológicos y pruebas serológicas. Entre estas últimas, la inmunodifusión doble tiene una amplia aceptación por ser la más simple, de bajo costo y presentar una elevada especificidad y adecuada sensibilidad.1

Teniendo en cuenta que Aspergillus fumigatus es la especie responsable de la mayoría de los casos de aspergilosis que se presentan en el mundo entero,1,2 en el Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" el diagnóstico serológico de esta enfer medad se realizaba hasta el presente utilizando antígenos de esta especie;3 sin embargo, Aspergillu niger, Aspergillus flavus y Aspergillus terreus desempeñan también un papel importan te en la causa de la aspergilosis. Como forma de ampliar las posibilidades diagnósticas del Laboratorio, hemos decidido contribuir al completamiento del sistema de diagnóstico serológico de esta micosis mediante la elaboración de antígenos metabólicos de estas 3 especies con sus respectivos antisueros para ser utilizados en el montaje de técnicas de inmunoprecipitación.

MATERIAL Y METODO

Cepas. Fueron utilizadas las siguientes cepas autóctonas, aisladas de pacientes: Aspergillus flavus 0111, A. niger 070 y 0138. Además se emplearon las cepas de A. flavus 062, A. niger 0,63 y A. terreus 061 procedentes del Instituto Pasteur de París.

Antígenos de referencia. Antígenos metabólicos de A. niger, A. flavus y A. terreus (Diagnostics Pasteur 7D 105).

Antisueros de referencia. Antisueros anti-A. niger, anti-A. flavus y anti-A.terreus (Diagnostics Pasteur 7L 105).

Obtención de los antígenos. Se siguió la metodología de trabajo descrita por Palmer et al.4 Cada antígeno fue concentrado 10 veces en AMICON con membrana YM30. La concentración de proteínas fue determinada por el método de Lowry.5

La capacidad antigénica de cada filtrado se comprobó mediante inmunodifusión doble (IDD), colocando los antígenos en los pozos periféricos y el antisuero de referencia en el centro. Se consideró aceptable aquel antígeno que, al ser comparado con el antígeno de referencia, fuera capaz de formar al menos una banda de identidad frente al antisuero homólogo de referencia.4 ]]> Obtención de los antisueros. Los antisueros fueron obtenidos mediante la inoculación en conejos empleando diferentes vías, según esquema de Hearn.6

La evaluación y titulación de los reactivos obtenidos (antígeno y antisuero) se realizó mediante la técnica de IDD.4 Se consideró aceptable aquel antisuero que, al ser enfrentado a su antígeno homólogo de referencia formara al menos una banda de precipitación en la región media entre ambos; debe existir además, identidad total entre las líneas de precipitación de este antisuero y el correspondiente antisuero de referencia.4

RESULTADOS Y DISCUSION

Los filtrados de cultivo una vez concentra dos, tuvieron una concentración de proteínas que osciló entre 1,38 y 6,15 mg/mL, lo que se puede considerar adecuado para su utilización en técnicas serológicas. En trabajos previos realizados en nuestro laboratorio, en condiciones de cultivo similares, se obtuvo un antígeno metabólico de A. fumigatus con una concentración de proteínas de 1,84 mg/mL,3 el cual ha sido utilizado con buenos resultados en técnicas de inmunoprecipitación y ELISA. En el caso de las 3 cepas de A. niger se encontraron marcadas diferencias en cuanto a la concentración de proteínas (cepa 0138: 6,15 mg/mL; cepa 070: 1,38 mg/mL; cepa 063: 2,15 mg/mL); ha sido señalada por varios autores la gran variabilidad, que en ocasiones se presenta, entre cepas de una misma especie, e incluso procedentes de una misma región geográfica.7

La capacidad antigénica de los extractos pudo ser comprobada mediante la IDD utilizan do los correspondientes antisueros y antígenos de referencia de cada una de las especies. Los antígenos de las cepas 063, 070 y 0138 mostraron bandas de identidad con los de referencia, aunque también se pueden apreciar bandas de identidad parcial. El preparado antigénico de la cepa 0138 es el que mayor cantidad de sistemas precipitantes presentó (4) frente al antisuero de referencia, incluyendo una fuerte banda de no identidad. Una mejor identidad se observó en los preparados antigénicos de las cepas de A. flavus y A. terreus frente a sus respectivos antisueros homólogos de referencia. Es bien conocido, que en los hongos del género Aspergillus existe un verdadero mosaico antigénico, debido fundamentalmente a la presencia de residuos de ß (1-5) D-galactofuranosyl (galac- tomananos), y donde además de estos determinantes propios del género, existen antígenos de especie e incluso dentro de cada especie la variabilidad de estos antígenos es grande.2,8 Esto pudiera explicar la aparición de bandas de identidad parcial o de no identidad entre cepas de una misma especie.

El esquema de inmunización empleado, mediante diferentes vías de inoculación, hizo detectable la respuesta humoral en un tiempo más corto en comparación con otros esquemas ensayados en nuestro laboratorio con anterioridad.2,3,9

Los mayores títulos fueron obtenidos en los sueros de los conejos inoculados con los preparados antigénicos de las cepas 062 y 0138 (1:64 y 1:16, respectivamente). En el caso de las cepas 070 y 0111, los títulos alcanzados fueron de 1:2, lo que nos pudiera indicar que estas cepas tienen menos poder inmunogénico o que la respuesta humoral de los conejos fue menos intensa; no obstante, los títulos de 1:2 se consideran aceptables para el empleo de un antisuero como control en las pruebas de inmunoprecipitación.4 Consideramos que se debe continuar el trabajo en este sentido, ya sea logrando esquemas de inmunización más efectivos u obteniendo antígenos más elabora dos. Al mismo tiempo, resulta imprescindible continuar en la búsqueda y selección de cepas autóctonas de Aspergillus con mayor capacidad antigénica procedentes de muestras clínicas.

Se encontró una buena especificidad intraespecie; cada uno de los antígenos de las cepas de A. niger fue reconocido por su respectivo antisuero homólogo y por los antisueros obtenidos a partir de otras cepas de la misma especie, lo que confirma la existencia de antígenos de especie, además de la variación entre cepas. Una situación similar se presentó entre los antígenos de A. flavus.

Como se ha señalado, las especies de Aspergillus comparten también determinantes antigénicos de género, los cuales generalmente se expresan de manera más débil que los homólogos, aunque otros autores han señalado que en ocasiones los determinantes antigénicos de género son reconocidos mucho más fácilmente que los de especie, dando lugar a las reacciones cruzadas intragenéricas.2 En nuestra experiencia observamos estas reacciones cruzadas entre el antígeno 0138 (A. niger) y el antisuero 061 (A. terreus) y entre el antígeno 061 y el antisuero 0111 (A. flavus); en ambos casos aparecieron finas y tenues bandas de precipita ción, que fueron más débiles que frente al reactivo complementario homólogo.

Un cierto número de casos de aspergilosis pudieran quedar sin diagnóstico si éste se basara en el uso de antígenos y antisueros controles de una sola especie, aunque ésta sea A. fumigatus. Es por ello que resulta imprescindible disponer de una batería de estos reactivos biológicos estandarizados de las principales especies patógenas, A. flavus, A. niger y A. terreus.2,4,7,10

Las pruebas de inmunoprecipitación, y en particular la IDD, ha sido ampliamente reconocida como una prueba de gran utilidad para el diagnóstico de las micosis profundas y en particular de la aspergilosis.11,12 Su sencillez, bajo costo, buena sensibilidad y alta especificidad cuando se emplean controles adecuados, la hacen una prueba de amplio uso en la actualidad.1,12 Además, se ha podido correlacionar la aparición y número de bandas con las principales formas clínicas de la enfermedad, lo que le confiere un valor adicional a esta prueba.11 Hay que tener en cuenta también la posible aparición de bandas en sueros de individuos sanos debido a la ubicuidad de estos hongos en la naturaleza.1,12

En los últimos años la aspergilosis se ha convertido en una importante micosis oportunista; entre los principales factores predisponentes se encuentran la neutropenia, los linfomas, los tratamientos con corticosteroides y los transplantes de órganos y más recientemente se ha incluido también al SIDA.7,13,14 Su diagnóstico debe realizarse mediante una correcta valoración de los datos clínicos, radiológicos, micológicos y serológicos.2,12,14 En la medida en que se obtengan preparados antigénicos y los corres pondientes antisueros de una calidad superior, contribuiremos a lograr un diagnóstico más efectivo de esta micosis.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Recibido: 24 de diciembre de 1994. Aprobado: 9 de mayo de 1995.

Lic. Carlos M. Fernández Andreu. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.

1Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar. Laboratorio de Micología, Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"(IPK).
2Licenciado en Microbiología. Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CENIC).
3Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Agregado. IPK.
4Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora. IPK. ]]> ]]> 1991 59-69 1992 30 11-25 1992 44 3 3 215-9 1977 111-22 1951 193 265-75 1984 130 907-17 1991 28 ^s(B Suppl) ^s(B Suppl) (B Suppl) 1-16 1984 22 381-94 1980 61-7 1991 8 435-42 1988 3 642-46 1984 20 3-4 3-4 32-43 1992 14 66-74 1994 70-8