Rev Cubana Med Trop 1996;48(1)

Artículos Originales

Tres combinaciones de esterasas y su relación con la resistencia a insecticidas organofosforados, carbamatos y piretroides en Culex quinquefasciatus Say, 1823 (Diptera: Culicidae) de Cuba

¹ Licenciado en Biología.
² Licenciado en Bioquímica.
³ Técnica en Biología.

RESUMEN

La posible relación entre diferentes patrones de esterasas y la resistencia a distintos tipos de insecticidas fue analizada mediante la realización de bioensayos, pruebas bioquímicas y electroforesis llevados a cabo en una población de Culex quinquefasciatus de Camagüey y en 3 colonias obtenidas a partir de ésta, mediante la selección por familias. La población original se caracterizó por ser heterogénea para la resistencia y presentar 8 combinaciones de esterasas en gel de poliacrilamida; de éstas las más frecuentes, y que caracterizaron a cada una de las colonias seleccionadas, fueron: A3A6B6, B1B6 y B1A6B6. Cada una de las colonias estudiadas, incluida la parenteral, mostró diferentes niveles de resistencia frente a los distintos insecticidas, sólo la resistencia a propoxur presentó menor variación. En todas las colonias parece existir una combinación de mecanismos de resistencia; sin embargo; diferencias encontradas en las pruebas con insecticidas sinergiados con DEF demuestran que las diversas bandas de los zimogramas pueden representar esterasas que contribuyen de forma diferente a la resistencia.

Palabras clave: RESISTENCIA A INSECTICIDA; ESTERASAS; CULEX; INSECTICIDAS DE CARBAMATO; INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS.

INTRODUCCION

Los estudios desarrollados por Bisset et al.^1,2 permitieron conocer la presencia de poblaciones de mosquitos Culex de Cuba con 2 mecanismos de resistencia: uno que presenta una elevada actividad de las esterasas no específicas y otro basado en una alteración de la enzima acetilcoli nesterasa (AchE).

La resistencia cruzada entre organofosforados y carbamatos está bien estudiada en poblaciones de campo.^3-7 Existen trabajos en los que se demuestra la intervención de las esterasas en la resistencia a organofosforados⁸ y se ha sugerido su participación a la vez en la detoxificación de los carbamatos.⁹ También se ha señalado el posible papel de las esterasas confiriendo resistencia a piretroides,^10,11 y se ha encontrado que intervienen de forma no muy intensa en ésta. ]]> Los estudios electroforéticos han mostrado un gran polimorfismo para las enzimas esterasas en poblaciones de campo de Culex quinquefas ciatus de diferentes regiones de Cuba. Las combinaciones de los distintos electromorfos pudieran intervenir de forma diversa en la resistencia a insecticidas.

El presente trabajo se propone investigar la posible relación entre diferentes patrones electroforéticos de esterasas y la resistencia a distintos tipos de insecticidas. Para ello se realizó el estudio de una población de Culex quinquefasciatus de Camagüey, resistente a insecticidas organofosforados, carbamatos y piretroides, y con diferentes combinaciones de esterasas en electroforesis en gel de poliacrila mida.

MATERIAL Y METODO

Se emplearon los siguientes insecticidas:

• Malatión: organofosforado, procedente de American Cyanamid Company.
• Propoxur: carbamato, procedente de Bayer Chemical Company.
• Deltametrina: piretroide, procedente de Hoescht Chemical Company.
• Sinergistas:
• S.S.S. tributilfosfotritiado (DEF): inhibidor de las esterasas, procedente de Bayer Chemical Company.
• Piperonil butóxido (PB): inhibidor de la multifunción oxidasa (MFO), procedente de Bayer Chemical Company.
]]>
En los ensayos con larvas de tercer estadio tardío o cuarto temprano, se efectuaron 5 réplicas con 20 larvas cada una. Las pruebas se realizaron en vasos plásticos que contenían 99 mL de agua destilada, y se aplicó 1 mL de las diferentes concentraciones del plaguicida preparado en acetona para lograr mortalidades desde 2 hasta 98 %. El mismo volumen de acetona se utilizó en los controles.

La acción de los sinergistas se estudió exponiendo las larvas a concentraciones subletales del DEF (0,4 p.p.m.) y de PB (0,8 p.p.m.) durante 4 horas, luego se adicionó 1 mL de la solución del insecticida a diferentes concentraciones.

Tanto en los bioensayos como en las pruebas con sinergistas la lectura de las mortalidades se realizó a las 24 horas, se calculó la CL50 y la CL90 (concentraciones que causan el 50 y el 90 % de mortalidad, respectivamente) mediante el programa Probit-log.12
PRUEBAS BIOQUIMICAS

Las larvas y adultos fueron homogenizados de forma individual en 200 mL de buffer fosfato (0,02 M; pH = 7,5) a 4 ·C de temperatura. Según el método de Hemingway et al¹³ se determinó la actividad de la enzima acetilcoli nesterasa (AchE) normal e inhibida con propoxur. La actividad de las esterasas se determinó individualmente tanto en larvas como en adultos según el método descrito por Peiris y Hemingway.¹⁴ Se determinó la frecuencia de los genes de la resistencia (FG) para la AchE modificada y para las esterasas elevadas según la fórmula del equilibrio de Hardy-Weinberg:

              FG = 1-raíz cuadrada (SS/T)

donde: SS = total de individuos susceptibles

              T = total de individuos testados
ELECTROFORESIS ]]> Se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para la identificación de las esterasas, se emplearon las siguientes soluciones:

• Buffer del gel 0,1 M tris borato/EDTA pH = 8,6: 60,55 g Tris (0,1 M), 9,5 g EDTA (0,0025 M) y 21,2 g ácido bórico (0,04 M). Se completó a 5 litros con agua destilada.
• Para el gel de corrida se prepararon 3 soluciones.
• Solución A: 2,25 g de metil bis-acrilamida +75 g de acrilamida en 500 mL de agua destilada. Esta solución se filtró antes de usarse con papel de filtro Whatman #1.
• Solución B: 25 g de sacarosa en 250 mL de buffer del gel.
• Solución C: 0,16 % de sulfato de amonio en agua destilada. Se preparó inmediatamente antes de usarse.
Todas estas soluciones se mezclaron y se adicionó agua destilada en proporción 1:1:1:1. Se utilizó N,N,N,N tetrametilen diamino (TEMED) como catalizador, en una proporción de 0,75 mL por mL de solución.

Previo a las electroforesis se determinó la actividad enzimática de las esterasas y se seleccionaron las muestras de mayor actividad; aplicándose 10 mL de cada una de ellas + 10 mL del marcador xilen-cianol (0,5 % diluido en sacarosa 5 %). La corrida se realizó a 200 volts durante aproximadamente 1 hora. Para la coloración se sumergió el gel en 50 mL de buffer fosfato que contenía 4 mL de cada uno de los sustratos específicos de las esterasas (1-naftil acetato y 2-naftil acetato) y se añadió 0,5 g del colorante fast-blue. Posteriormente el gel se enjuagó con agua destilada y se sumergió en ácido acético al
10 % para fijar la coloración de las bandas. Con el fin de identificar éstas, se corrió en cada gel una muestra de la cepa de referencia MRES que contiene la esterasa B1. Las otras fueron identificadas por sus valores de Rf comparados con los reportados en la literatu ra internacional.¹⁵ ]]> FAMILIA SIMPLE

Las balsas de la cepa "Nuevitas" se colocaron por separado en copas que contenían 100 mL de agua destilada y al eclosionar, las larvas se alimentaron con harina de pescado. Cuando alcanzaron el cuarto estadio se tomaron al azar
8 individuos por copa y se les realizó la prueba bioquímica para la determinación de las esterasas elevadas. Se escogieron las muestras de mayor actividad enzimática (estimadas visualmente según la intensidad del color) y se realizó la corrida electroforética. Se crearon diferentes colonias con las larvas de cada familia que presentaban un patrón uniforme para las combinaciones de esterasas más frecuentes en PAGE. Las colonias seleccionadas se sometieron a las pruebas descritas para la cepa "Nuevitas". En todos los casos se utilizó como cepa susceptible de referencia la cepa Bleuet, procedente de la Universidad de Montpellier, Francia.

RESULTADOS

Los datos aportados por los bioensayos (tabla 1) (tabla 2) permiten caracterizar a "Nuevitas" como una cepa resistente a malatión y con genes para la resistencia a propoxur y deltametrina. A su vez, los resultados de los ensayos con sinergistas y de las pruebas bioquímicas (tabla 3) (tabla 4) indican que en esta cepa la resistencia se debe a una combinación de diferentes mecanis mos de detoxificación: esterasas elevadas, AchE modificada y oxidasas de función múltiple. Por otra parte, los estudios electroforéticos revela ron la presencia en los zimogramas de 8 combinaciones de esterasas: A2A3A6B6, B6, A2B1B6, A2B1A6B6, B1, A3A6B6, B1B6 y B1A6B6. Los 3 últimos patrones fueron los más frecuen tes en la población, contribuyendo con 8,8; 18,8 y 51 %, respectivamente, a la resistencia mediada por esterasas, lo que representa en su conjunto el 78,6 % de ésta. Basado en ello se crearon las colonias NA, NB y NC caracteriza das cada una de ellas por poseer una combinación enzimática típica de las 3 señaladas como más frecuentes; A3A6B6, B1B6 y B1A6B6, en ese orden.

En la tabla 1 se muestran los valores de las concentraciones que produjeron 50 y 90 % de mortalidad en cada colonia, así como el factor de resistencia y el grado de homogeneidad de éstos (a través de los valores de la pendiente b) frente a malatión, propoxur y deltametrina, comparados con los de la cepa parental "Nuev itas" y la cepa susceptible de referencia Bleuet. Resulta interesante que cada una de las colonias seleccionadas mostró diferentes niveles de resistencia frente a los distintos insecticidas, aunque la resistencia a propoxur presentó menor variación. Las larvas de mosquitos con la combinación de esterasas B1B6 fueron las más resistentes a malatión, mientras que las que poseían el patrón B1A6B6 mostraron el nivel más alto de resistencia a deltametrina. Al analizar las pendientes de las rectas de regresión dosis-mortalidad (b) de NA, NB y NC se aprecia que la resistencia fue más homogénea para propoxur en las diferentes colonias, con valores muy cercanos o superiores a 2. En relación con malatión y deltametrina en las mismas cepas las poblaciones fueron más heterogéneas.

TABLA 1. Valores de las concentraciones letales para 3 insecticidas, calculados en la cepa de Culex quinquefasciatus "Nuevitas" y en las 3 colonias con diferentes combinaciones de esterasas

Cepa	Malatión ]]>        CL50       CL90       b	Propoxur         CL50       CL90       b	Deltametrina        CL50         CL90           b
"Nuevitas"	1,10       3,90     2,4        (0,4)	2,06       51,0     0,9        (0,9)	0,002        0,02        1,1       (0,0009)
]]> NA  (A3A5B6)	0,90      5,60      1,6        (0,2)	2,37       10,60    1,9        (0,5)	0,00005    0,0004    1,4       (0,00001)
NB (B1B6)	3,93     41,88     1,2        (1,2)	0,84          2,67     2,5  ]]>      (0,1)	0,0006      0,005      1,4       (0,0004)
NC (B1A5B6)	0,05       0,26     1,8        (0,01)	2,18         7,02     2,5        (0,4)	0,005        0,02        1,7       (0,001)
Bleuet	0,08       0,13     9,1	0,37         0,46     9,6	0,0003      0,0004    6,4

( ): +/- Desviación estándar. ]]> b: Pendiente de la recta de regresión dosis-mortalidad. Bleuet: Cepa susceptible de referencia. TABLA 2. Valores de los factores de resistencia (FR50) de la cepa de Culex quinquefasciatus "Nuevitas" y en 3 colonias con diferentes combinaciones de esterasas

Cepa	Malatión	Propoxur	Deltametrina
"Nuevitas"	13,7	7,6	6,7
NA ]]> (A3A5B6)	11,2	6,4	0,1
NB (B1B6)	49,1	2,2	]]> 2,1
NC (B1A5B6)	0,6	5,8	17,6

 
Para el análisis in vivo de los mecanismos de resistencia se utilizó DEF como inhibidor de las esterasas y PB como inhibidor de las oxidasas de función múltiple. Al comparar la acción del DEF frente a los diferentes insecticidas (tabla 3) se observa que la inhibición de las esterasas aumenta la toxicidad del malatión en NA y NB y no tiene prácticamente efecto en NC. Para el propoxur las 3 combinaciones de esterasas parecen ser importantes en la resistencia, aunque el papel más notable se manifestó en NA. A diferencia de esto, sólo en NC se observó la influencia de las esterasas en la resistencia a deltametrina. En cuanto al sinergis mo con PB (tabla 3), éste se evidenció frente a malatión en NB y frente a deltametrina en NC. Para el propoxur las oxidasas de función múltiple contribuyeron a la resistencia de forma notable sólo en NA.

Como se muestra en la tabla 4, las colonias NB y NC mostraron las frecuencias más altas de los genes que codifican para las esterasas elevadas, y más bajas para los de la AchE modificada, mientras en NA ocurrió lo contrario. Sin embargo, en las 3 colonias fue elevada la frecuencia de los genes para la resistencia correspondiente a ambos mecanismos, por lo que debe considerarse que, aunque de forma diferente, los 2 deben jugar un importante papel en la resistencia.

]]> TABLA 3. Factores de sinergismo en larvas de Culex quinquefasciatus de la cepa "Nuevitas" y en 3 colonias con diferentes combina ciones de esterasas

Cepa	Malatión      DEF     PB	Propoxur     DEF     PB	Deltametrina ]]>     DEF     PB
"Nuevitas"	5,1      3,9	5,8      8,5	10,5     2,2
NA (A3A5B6)	4,5      0,4	18,5     7,1	0,1     0,9
NB (B1B6)	23,1     3,9	2,8      1,0	0,1      0,7
NC ]]> (B1A5B6)	0,2     0,1	6,2       2,4	7,3      9,2

  TABLA 4. Frecuencias génicas en Culex quinquefasciatus de la cepa "Nuevitas" y en 3 colonias obtenidas a partir de ésta mediante selección por familias

Cepa	Esterasas	AchE
"Nuevitas"	0,79 (96)	0,34 (94)
NA ]]> (A3A5B6)	0,88 (94)	0,96 (94)
NB (B1B6)	1,00 (94)	0,86 (94)
NC (B1A5B6)	1,00 (94)	0,70 (94)

( ) Total de individuos empleados en el ensayo.

DISCUSION

Es conocida la resistencia que han desarrollado varias especies de mosquitos a insecticidas organofosforados,^16,17 pero la evolución de los genes de la resistencia en poblaciones naturales, está poco estudiada ( Rivet et al., inédito). Callaghan et al.¹⁷ hallaron relación entre esos insecticidas y elevadas actividades de carboxilesterasas A y B en Culex quinquefasciatus. Wirth et al.¹⁸ señalan que la resistencia múltiple a organofosforados en Culex quinquefasciatus de California (1974), fue causada por un gen simple que codificaba para la esterasa B1. Khayrandish y Wood¹⁹ sugirieron la conexión entre las esterasas y la resistencia a organofosfo rados. Dichas enzimas se nombraron en el zimograma acorde con su movilidad electroforética, como A2, A3, B2 y B3. Estos mismos autores señalan que el nivel de actividad de las esterasas A2 y B2 puede ser diferente, mientras que Raymond et al.¹⁵hallaron un incremento de la banda A2 sin un correspondiente incremento de la actividad en el resto de las bandas.

A partir de nuestros resultados se puede inferir que la actividad enzimática de las bandas A reportadas para la población parental "Nuevitas", no parece tener un papel significativo en la detoxificación del malatión; pues los valores más altos de FR50 y FS con DEF para este insectici da se obtuvieron en NB, y precisamente esta colonia se distinguía por no presentar esterasas A en su zimograma. Esto indica a su vez que B1 y B6 pueden jugar un importante papel en la resistencia a este insecticida, al igual que B2 para la cepa Caracas de Venezuela, como observaron Khayrandish y Wood (sin publicar).

Sin embargo, para el carbamato propoxur las bandas A en combinación con las B (NA y NC) son importantes al parecer en los niveles de resistencia que poseen estas poblaciones a este químico (tabla 2). Es interesante apreciar que esos niveles no se diferencian considerable mente de los reportados para la población que originó esas combinaciones ("Nuevitas"). ]]> NA y NB exhibieron valores superiores de factor de sinergismo (FS) con DEF frente a malatión y propoxur, en relación con los obtenidos con PB para estos insecticidas. Ello podría indicar que quizás en estas colonias las esterasas tengan mayor incidencia que las multifunción oxidasas en la resistencia, aunque no se distingue en particular ninguna banda del zimograma.

Mouches et al.²⁰ observaron elevadas actividades de las esterasas A1 y B1 en Culex quinquefasciatus de California, en la detoxificación de organofosforados y carbamatos. Por su parte, Hemingway et al.²¹ demostraron el papel de las esterasas y las multifunción oxidasas (MFO) de forma combinada en la resistencia a organofosforados y carbamatos en Culex quinquefasciatus de Arabia Saudita, lo que coincide con nuestros resultados para NB frente a malatión y NA, NB y NC ante propoxur.

Raymond et al.,²² Peiris,²³ y Magnin et al.²⁴ señalan que las esterasas no intervienen en la resistencia a piretroides. Sin embargo, Bisset et al.² observaron en Cuba un tipo de resistencia incipiente en el terreno para deltametrina, lo cual se asoció al alto sinergismo de este insecticida con DEF.

Al parecer, un nuevo y selectivo mecanismo de detoxificación derivado de una elevada actividad de esterasas inespecíficas está apareciendo en especies del complejo Culex de Cuba. Si bien este mecanismo no confiere altos niveles de resistencia a los piretroides, sí protege a los mosquitos frente a este insecticida.

De nuestros datos se sugiere, por tanto, que las esterasas intervienen causando resistencia a los piretroides de forma combinada con las MFO; pues como se observó, la combinación B1A6B6, presentó sinergismo con DEF y PB ante deltametrina y fue la única resistente a este insecticida. Esto coincide con lo encontrado por Bisset et al.2 en poblaciones de Cx. quinquefascia tus de Ciudad de La Habana, en lo referente a involucrar a las esterasas en la resistencia a piretroides.

Las distintas combinaciones de enzimas esterasas y mecanismos de resistencia presentes en la cepa "Nuevitas" se corresponden con su espectro de resistencia. Las diferencias mostradas por las 3 colonias seleccionadas demuestran que las diversas bandas en los zimogramas pueden representar esterasas que intervienen de forma diferente en la resistencia. También pudieran estar involucradas en la estabilización de la resistencia, bajo condiciones de presión de selección con insecticidas, al igual que ocurre con las esterasas A2 y B2 en Sri Lanka.⁴ En este sentido es importante continuar los estudios para esclarecer el papel de cada banda y de las combinaciones en las que pueden aparecer agrupadas.

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Lic. Juan A. Bisset. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba. ]]> 1990 80 160-8 1991 5 223-8 1983 19 167-71 1983 73 153-70 1987 27 218-28 1985 11 1982 17 149-55 1991 43 171-4 1990 4 275-82 1973 17 9 1235-6 1974 4 465-72 1985 23 117-21 1986 76 359-65 1990 80 453 1991 350 151-3 1990 18-41 1991 41 198-206 1990 27 202-6 1993 83 67-74 1990 84 2574-8 1990 4 275-82 1987 24 24-9 1989 80 453 1988 25 99-104