0375-07600375-0760S0375-07601996000100005Cuba00041996000419964812633Cría masiva de Romanomermis culicivorax (Nematoda: Mermithidae) en las condiciones tropicales de Cuba
Rev Cubana Med Trop 1996;48(1)
Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Cría masiva de Romanomermis culicivorax (Nematoda: Mermithidae) en las condiciones tropicales de Cuba
Lic. ALBERTO SANTAMARINA MIJARES1 1 Doctor en Ciencias Biológicas. Investigador Auxiliar.
RESUMEN
Para desarrollar el proceso de producción masiva a gran escala del nematodo parásito Romanomermis culicivorax Ross y Smith, 1976, en las condiciones tropicales de Cuba, se tuvo en cuenta la estandarización de un número determinado de variables, tales como: utilización de huevos en el proceso de infectación, dosis, tipos de agua, tipos de sustrato, temperatura, método de siembra de los cultivos y métodos de almacenamiento de los lotes de cultivos. Altos rendimientos en nematodos y aproximadamente igual número de hembras y machos fueron obtenidos cuando se expusieron larvas de mosquitos de la especie Culex quinquefasciatus Say, 1823, a larvas infectivas del parásito.
Palabras clave: NEMATODA; CULEX; CONTROL DE INSECTOS; CLIMA TROPICAL; CUBA.
INTRODUCCION
El nematodo mermítido Romanomermis culicivorax Ross y Smith, 1976, fue estudiado en Cuba como un posible agente de control biológico de las altas densidades poblacionales de larvas de mosquitos que crían en diferentes hábitats. De acuerdo con las investigaciones desarrolladas en laboratorio y campo, se determinó que R. culicivorax representa un control natural de los estadios larvales de diferentes especies de mosquitos y se han reportado previamente elevados niveles de susceptibilidad a la infectación de este mermítido.1
La liberación experimental de las formas infectivas de este parásito en criaderos naturales demostraron que, una vez que fueron introduci das, se establecieron, mudaron, maduraron y depositaron huevos en el sustrato. Los preparasíticos emergieron de estos huevos y proporcio naron un control continuado en las subsiguien tes estaciones de cría del mosquito.2-4
Para la utilización de R. culicivorax como un biolarvicida para el control de larvas de mosquitos, el parásito tiene que ser multiplicado masivamente y deben ser obtenidas altas producciones. Con este objetivo se llevó a cabo la estandarización de las variables más importantes.
MATERIAL Y METODO
EVALUACION DE DISTINTAS DOSIS
Los experimentos se desarrollaron con larvas de mosquito de la especie Culex quinquefascia tus, para evaluar los niveles de infectación y los tantos por cientos de mortalidad a diferentes dosis. Con este objetivo fueron colocados 3 grupos de 800 larvas (200/estadio) de I-II-II y IV estadio en agua destilada, con pH 6,3; conductividad de 1,5 ms/cm y expuestas a una dosis de 3:1; 5:1 y 10:1 por cada grupo de larvas, respectivamente. ]]>
TIPOS DE AGUA
Fueron analizados diferentes tipos de agua.
Experimento I. Doscientas larvas de mosquitos de la especie C. quinquefasciatus en II estadio de desarrollo fueron colocadas en agua destila da, con pH 6,4 y conductividad de 1,4 ms/cm. Posteriormente las larvas fueron expuestas a los preparasíticos infectivos en dosis de 5:1.
Experimento II. Otras doscientas larvas de mosquito de la misma especie en II estadio de desarrollo se expusieron a los preparasíticos en dosis de 5:1, en agua libre de cloro, con pH 6,5 y conductividad 1,8 ms/cm; purificada a través de un sistema de resinas por intercambio iónico.
Experimento III. Doscientas larvas de mosquito de C. quinquefasciatus en II estadio de desarrollo se colocaron en agua de lluvia, con pH 7,0 y conductividad, 1,12 ms/cm y se expusieron a los juveniles infectivos del nematodo en dosis de 5:1.
Experimento IV. Otro grupo de 200 larvas de mosquito de la misma especie y en II estadio de desarrollo se expusieron a los juveniles del parásito en igual dosis que la anterior, en agua obtenida de presas o embalses, con pH 7,1 y conductividad de 1,2 ms/cm.
UTILIZACION DE HUEVOS EN LOS PROCESOS DE INFECTACION ]]>
Fueron realizadas distintas pruebas de laboratorio para evaluar si en el proceso de infectación resultaba posible la utilización de balsas (que contiene los huevos) en lugar del uso directo de larvas de mosquito en II estadio de desarrollo. Con este objetivo, 3 grupos de 8 balsas con 120 huevos cada una, obtenidas de hembras adultas de mosquitos de la especie C. quinquefasciatus fueron colocadas en agua destilada, con pH 6,1 y conductividad de 1,1 ms/cm. Tres días después las larvas en II estadio de desarrollo se expusieron a los preparasíticos en dosis de 5:1.
TEMPERATURA
Fueron conducidas pruebas de laboratorio para determinar la influencia de distintas temperaturas con valores de 23, 26, 29 y 32 oC en el tiempo del proceso de la infectación, así como en la talla de los nematodos posparásitos. Para ello, se expusieron 4 grupos de 200 larvas de mosquito de la especie C. quinquefasciatus en II estadio a los preparasíticos infectivos en agua destilada, con un pH 5,6 y conductividad de 11,4 ms/cm; a una dosis de 5:1. Para cada grupo de larvas se aplicó un valor distinto de temperatura.
TIPOS DE ARENA
Fueron evaluados diferentes tipos de arena de río como medio de cultivo para la siembra de los nematodos posparásitos. Con este objetivo, el primer tipo de arena fue colectado en un río localizado en el Valle de Viñales (en el kilómetro 102 de la carretera hacia la ciudad de Pinar del Río), ésta era de color amarillo-carmelita, con una composición química a base de carbo nato de calcio y un diámetro del grano entre 1,87 y 6,25 mm. El segundo tipo de arena fue obtenido del río El Macío, en Pilón, Sierra Maestra, en la provincia Gramma, era de color gris-oscuro, composición química a base de carbonato de calcio y un promedio en el tamaño del grano entre 11,78 y 0,88 mm. El tercer tipo de arena fue colectada en un arroyo próximo al Presidio Modelo, en el Municipio Especial Isla de la Juventud, su color era blanco-carmelita, a base de carbonato de calcio y un tamaño del grano entre 1,52 y 7,05 mm. El último tipo de arena fue obtenido en el río Guajaibón ubicado en El Mariel, provincia La Habana, con un color oscuro, a base de carbonato de calcio y un tamaño del grano entre 1,61 y 7,01 mm. El rendimiento en número de preparasíticos en los lotes de cultivos con las distintas variantes de arena fue determinado por el método de dilución volumétrica.5 ]]>
ALMACENAMIENTO DE CULTIVOS
Se realizaron otros estudios de laboratorio para evaluar el método de almacenamiento de los cultivos del parásito. Con este objetivo se tomaron 30 cultivos de nematodos, cada uno de los cuales contenía 40 hembras y 40 machos, a los que se les adicionó una ligera capa de agua destilada de 1 cm para facilitar el desplazamiento de los parásitos al fondo del cultivo. Un grupo de 15 cultivos fue almacenado en un local a temperatura ambiente de 27 oC durante 3 semanas, al término de las cuales fue extraída el agua y almacenados nuevamente por 15 semanas adicionales. Al lote restante de 15 cultivos, una vez observado el descenso de los nematodos (tiempo promedio de 30 minutos), le fue extraída el agua por decantación, cubiertos herméticamente y finalmente almacenados durante 8 semanas en iguales condiciones. Una vez transcurrido el tiempo de almacenaje, ambos lotes de cultivos fueron inundados con agua destilada para inducir la eclosión de los huevos y evaluar el rendimiento en número de prepara síticos y su viabilidad.
Los diferentes grupos de balsas y larvas de mosquito utilizados en los experimentos fueron obtenidos de las colonias, mantenidas en altas densidades en el insectario, con una humedad relativa de 82,3 % y un rango de temperatura entre 26 y 28 oC. Todos los experimentos con larvas de mosquito expuestas a los preparasíticos en el laboratorio se desarrollaron en bandejas esmaltadas de 44 x 34 x 4 cm, colocadas en una incubadora, a una temperatura de 29 oC. Para la alimentación de las larvas hospederas se utilizó harina de pescado. Para determinar el número de huevos por balsa y la talla de los nematodos hembras y machos, se utilizó un microscopio estereoscópico marca WILL HEERBRUGG M38, con un micrómetro ocular (10x).
Para el proceso de siembra de los nematodos posparásitos se utilizaron depósitos plásticos de 20 x 10 x 6 cm, cubiertos herméticamente y almacenados a temperatura ambiente. Para todas las pruebas de laboratorio se utilizó un testigo y se realizaron 3 réplicas por cada experimento. Los cultivos de laboratorio fueron inundados con agua destilada y el número de preparasíticos necesario para la infectación de las larvas hospederas fue calculado mediante el método de dilución volumétrica.5 Para calcular la media de infectación y el tanto por ciento de mortalidad se tomó de forma aleatoria una muestra de 50 larvas, las cuales fueron disecadas mediante agujas entomológicas y a través de un microscopio estereoscópico.6 En todos los resultados se da el valor medio de infectación y el tanto por ciento de mortalidad, pero sólo se analiza estadísticamente el primero, pues el porcentaje de mortalidad mostró una correla ción cercana a 1 (r = 0,92; p < 0,001) con el valor medio de infectación.
Todos los datos obtenidos fueron analizados estadísticamente. Previamente se comprobó si éstos presentaban distribución normal y homo geneidad de varianza. El test de Kolmogorov- -Smirnov indicó que la variable mencionada no presentaba distribución normal, por lo que todos los valores de la variable fueron transformados a log (x + 1). Se utilizó un ANOVA bifactorial para los efectos estadios larvales y dosis de aplicación sobre el valor medio de infectación y 3 ANOVA de clasificación simple: para el efecto de los tipos de agua sobre el valor medio de infectación, para el efecto de la temperatura sobre el valor medio de infectación y para el efecto de la temperatura sobre la talla de los nematodos. Para establecer las diferencias entre medias se utilizó una prueba Duncan. Se consideró un nivel de significación de p = 0,05.
RESULTADOS
EVALUACION DE DIFERENTES DOSIS
Los resultados mostraron un incremento en los niveles de parasitismo en relación con el aumento de la dosis de aplicación desde 3:1 hasta 10:1. Los más altos niveles de infectación correspondieron a la dosis de 10:1, en larvas de II estadio, con valores medios de infectación de 4,3 y 100 % de mortalidad. Mediante la aplicación de un ANOVA se observó que tanto el efecto de la dosis como el estadio larval afectaron los valores medios de infectación (F = 899,5; p < 0,001) para el efecto dosis y (F = 230,1; p < 0,001) para el efecto estadio larval, mientras la interacción dosis x estadio larval no fue estadísticamente significativa. Mediante una prueba Duncan se observó que las 3 dosis fueron significativamente diferentes (p < 0,005), al igual que las medias halladas en los 4 estadios larvales (figura 1). ]]>
TIPOS DE AGUA
Para los 4 tipos de agua ensayados se encontraron los siguientes valores medios de infectación: 1,98 y 87 % de mortalidad para el agua destilada; 1,92 y 84 % de parasitismo para el agua obtenida a través del sistema de resinas; 1,89 con 84 % de mortalidad para el agua de lluvia y 1,97 con 86 % de mortalidad para el agua de presa (figura 2).
UTILIZACION DE HUEVOS EN EL PROCESO DE INFECTACION
Los estudios de laboratorio determinaron que una vez que los huevos eclosionaron y las larvas alcanzaron el segundo estadio de desarrollo, su exposición a las larvas infectivas arrojaron elevados niveles de parasitismo, muy similar cuando fueron expuestas directamente larvas de mosquito en II estadio de desarrollo a los nematodos infectivos. Los resultados obtenidos evidenciaron el uso práctico de huevos, con lo cual se evita la mortalidad prematura en las larvas como consecuencia del exceso de manipulación (tabla 1).
TABLA 1. Niveles de infectación y tantos por ciento de mortalidad en larvas de mosquito por R. culicivorax a partir de huevos de C. quinquefasciatus en dosis de 5:1
No. de Experimento
No. de balsas
Total de larvas
]]>
Infectación preparasíticos
Mortalidad
(?)
(%)
1
8
960
4
800
1,9
90
2
]]>
8
960
4
800
2,1
89
3
8
960
4
800
]]>
2,0
92
TEMPERATURA
Las pruebas de laboratorio llevadas a cabo con diferentes valores de temperatura no mostraron diferencias significativas entre los 4 valores medios de infectación obtenidos. El desarrollo del parásito tuvo un comportamiento normal en los 4 procesos de infectación a diferentes temperaturas con valores de: 23, 26, 29 y 32 oC. La temperatura de 29 oC resultó la más adecuada, tomando el proceso de infectación un tiempo de 6 días, no afectándose así la talla de los nematodos posparásitos (17 mm). Con valores de temperatura por debajo de 29 oC, el tiempo del proceso de infectación se incrementó. Contrario a esto, con una temperatura de 32 oC, el tiempo para este proceso se redujo a 5 días y por consiguiente se afectó la talla de los nematodos posparásitos (13 mm) (tabla 2, figura 3). Se encontró diferencia significativa (F = 15,7; p < 0,001) entre las muestras de nematodos obtenidas a distintas temperaturas. Mediante una prueba Duncan se observó que los posparásitos obtenidos con temperatura de 32 oC difieren (p < 0,05) de aquéllos obtenidos con temperaturas de 23, 26 y 29 oC.
TABLA 2. Niveles de infectación y tantos por ciento de mortalidad en larvas de mosquito de C. quinquefasciatus por R. iyengari a diferentes temperaturas
No. de Experimento
Total de larvas
Infectación preparasíticos
Mortalidad
]]>
Tiempo de infectación
Talla
(?)
(%)
T oC
(días)
(mm)
3
200
1 000
]]>
2,1
87
23
10
17
3
200
1 000
2,3
89
]]>
23
8
17
3
200
1 000
2,2
88
29
6
]]>
17
3
200
1 000
2,1
88
32
5
13
TIPOS DE ARENA ]]>
En las 4 variantes de arena de río utilizadas como medio de cultivo, el descenso de los nematodos al fondo de los cultivos ocurrió en un tiempo promedio de 30 minutos y las distintas tallas de los granos de arena permitieron el desplazamiento de los posparásitos a través de los espacios intergranos. Se encontró además que las variantes en color y la composición química de los granos de la arena no tuvieron una influencia negativa en la capacidad de reproducción de los nematodos adultos (tabla 3).
TABLA 3. Tipos de arena de río
Localidad
Composición
Diámetro del grano (mm)
Color
Valle de Viñales (Pinar del Río)
Carbonato de calcio
1,87 - 6,25
]]>
Pardo-amarillo
El Macío (Granma)
Carbonato de calcio
11,78 - 6,88
Gris-oscuro
Isla de Juventud
Carbonato de calcio
1,52 - 7,05
Blanco-carmelita
Guajaibón
]]>
(La Habana)
Carbonato de calcio
1,61 - 7,01
Negro
ALMACENAMIENTO DE LOS CULTIVOS
En el lote de 15 cultivos almacenados durante 18 semanas se obtuvo un rendimiento de 45 000 preparasíticos, de los cuales 18 000 (40 %) presentaron una inactividad total y el resto, 27 000 (60 %), mostraron una buena actividad. Sin embargo, en el lote de 15 cultivos que fueron almacenados durante 6 semanas, el rendimiento en número de preparasíticos fue de 75 000, de los cuales 67 500 (90 %) presentaron una elevada actividad y los restantes 7 500 (10 %) se encontraban inactivos (tabla 4).
TABLA 4. Almacenamiento de los cultivos de R. culicivorax
No. de cultivos
Método
]]>
Tiempo de almacenaje
No. de preparasíticos
Activos
(%)
Inactivos
(?)
15
Con agua
18 semanas
45 000
]]>
60
40
15
Sin agua
6 semanas
75 000
90
10
DISCUSION
EVALUACION DE DIFERENTES DOSIS
Se observó un aumento en los valores medios de infectación y en los tantos por ciento de mortalidad con el incremento de la dosis desde 3:1 hasta 10:1. Algunas investigaciones desarrolladas por otros autores7 reportaron altos porcentajes de infectación en larvas de C. quinquefasciatus por R. culicivorax con distintas dosis de aplicación, con valores desde 3:1 hasta 10:1. Los resultados hallados mostraron que los más altos índices de infectación en los 4 estadios larvales (I-IV) ocurrieron con la dosis de 10:1. Se observó además un superparasitismo como consecuencia de la dosis tan elevada, con la consiguiente muerte prematura (24 horas después de la infectación) del 50 % de las larvas infectadas. El análisis de los datos indicó que la dosis de 10:1 no resultó favorable, lo que implicó que el parásito no pudo desarrollarse por la muerte temprana de las larvas hospederas. Aunque con la dosis de 5:1 se encontró un decremento en los niveles de infectación, con un valor promedio de 2,0 en el II estadio, no se observó ninguna mortalidad 24 horas después de la infectación realizada. Esto evidenció que dicha dosis resultó más efectiva para el proceso de infectación en comparación con otras dosis ensayadas. Reportes de otros autores5-8 han indicado que larvas hospederas en I estadio de desarrollo han resultado expuestas directamente a los preparasíticos infectivos de R. culicivorax en una relación parásito-hospedero de 14:1, lo que presupone una elevada mortalidad prematu ra en las larvas hospederas a consecuencia del superparasitismo. ]]>
TIPOS DE AGUA
Los estudios realizados con los distintos tipos de agua demostraron sus posibilidades de utilización para la cría masiva del nematodo parásito R. culicivorax. Estos tipos de agua pueden ser obtenidos fácilmente y resulta económica su aplicación para el proceso de multiplicación del parásito. Además, el empleo de estas aguas arroja elevados rendimientos de nematodos posparásitos. Estos resultados no coinciden con lo reportado por otros autores,9-11 quienes informaron que en los procesos de infectación se utilizan grandes volúmenes de agua, las que son decloradas con tiosulfato de sodio y purificadas por un sistema de filtración reverso de ósmosis, con un valor de conductividad de 180 ms/cm, lo cual resulta mucho más costoso.
UTILIZACION DE HUEVOS EN EL PROCESO DE INFECTACION
La utilización de huevos en el proceso de infectación en lugar del empleo directo de larvas de mosquitos en II estadio de desarrollo resultó ser mucho más práctico. Ello permite una reducción marcada del tiempo y se evita la mortalidad temprana en dichas larvas hospederas a consecuencia del exceso de manipulación. Los resultados encontrados en las pruebas comparativas con huevos y larvas de mosquito no coinciden con lo planteado por otros autores,8 quienes indicaron que fueron expuestas directamente larvas de mosquito en primer estadio de desarrollo a los preparasíticos infectivos de R. culicivorax, a una dosis de infectación de 14:1, lo que provoca una alta mortalidad en las larvas como resultado de un superparasitismo.
TEMPERATURA ]]>
Con un valor de temperatura de 23 oC, el proceso de infectación tomó un tiempo de 10 días y los nematodos posparásitos emergieron con una talla adecuada: 17 mm la hembra y 10 mm el macho. Con una temperatura de 26 oC el proceso de infectación se redujo a 8 días y no se afectó la talla de los nematodos posparásitos. Un incremento de la temparatura a 32 oC afectó el desarrollo del sistema hospedero-parásito y la emersión de los posparásitos ocurrió en el quinto día. Además, fue observada una reducción en la talla normal de las larvas hospederas y de los posparásitos, lo que se atribuye a un incremento en la actividad metabólica y de la velocidad de desarrollo del ciclo de vida, como resultado del aumento de temperatura. Según otros autores11 una temperatura de 26 oC resultó adecuada para el proceso de multiplicación del parásito. Aunque este valor no afectó la talla de los posparásitos, el proceso de infectación se prolongó hasta los 8-9 días, a partir de los cuales ocurrió la emersión de los nematodos posparásitos. A diferencia de esto, una temperatura de 29 oC representó el valor óptimo, se encontró que el proceso de infectación tomó un tiempo de 6 días y no se observaron cambios, tanto en la talla como en la apariencia morfológica de los posparásitos obtenidos.
TIPOS DE ARENA DE RIO Los tipos de sustratos utilizados como medio de cultivo permitieron el descenso de los nematodos en un tiempo promedio de 30 minutos, lo que se atribuyó al tamaño de las partículas de arena y a los espacios intergranos que fueron suficientemente amplios para permitir el desplazamiento de los posparásitos desde la superficie al fondo de los cultivos. Aunque este aspecto no aparece en la literatura, en nuestra experiencia otros tipos de arena de grano más fino originaban una mayor compactación del sustrato, lo cual dificultaba el movimiento de los parásitos y por lo tanto su desplazamiento.
ALMACENAMIENTO
Los cultivos de nematodos almacenados con arena ligeramente húmeda por 6 semanas mostraron un alto rendimiento en número de preparasíticos. Algunos autores12,13 reportaron que en el proceso de cría masiva una vez concluido el proceso de siembra de los nematodos, los cultivos fueron almacenados con agua durante un período de 3 semanas. Posteriormente el agua fue decantada y los cultivos se almacenaron por 15 semanas adicionales hasta completar 18 semanas. El bajo rendimiento en cuanto al número de larvas infectivas en los cultivos se atribuye al largo período de almacenamiento y a la pérdida de un número considerable de preparasíticos en el agua decantada al término de las 3 primeras semanas de almacenaje. Esto se explica por el hecho de que una hembra de R. culicivorax oviposita un promedio de 832 huevos en los primeros 15 días, después de concluido el proceso de siembra y muchos de estos huevos completan su desarrollo embrionario a los 18 días,14 los cuales eclosionan en contacto con el agua contenida en los cultivos. Los preparasíticos emergidos de los huevos son extraídos conjuntamente con el agua decantada, lo cual incide finalmente en el bajo rendimiento de los cultivos a las 18 semanas de almacenamiento.
AGRADECIMIENTOS
Esta investigación recibió el apoyo financiero del UNDP/ /WORLD BANK/WHO del Programa Especial para Investigaciones y Entrenamiento en Enfermedades Tropicales.
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Lic. Carmen Ambrós Ginarte. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.