Rev Cubana Med Trop 1996;48(1)

Comunicación Breve

Secuenciación directa de un producto amplificado de una muestra de suero

RESUMEN

Palabras clave: VIRUS DEL DENGUE/genética; GENOMA VIRAL; ARN/sange; ADN/sangre; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA; SECUENCIA DE BASES/genética; SECUENCIA DE AMINOACIDOS/genética.

La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) revolucionó la biología molecular al permitir obtener niveles elevados de ADN que pueden ser caracterizados al nivel molecular sin la propagación extensiva del virus y sin necesidad de realizar el clonaje molecular.1

En América, en el transcurso de este siglo no se habían comunicado casos de fiebre hemorrágica del dengue síndrome de choque del dengue (FHD/SCD) hasta 1981 en Cuba, donde se produjo un brote causado por el virus tipo 2, el cual afectó al país completo y produjo un gran número de casos y muertes. Esta epidemia fue la primera de este tipo reportada en la región de Las Américas y probablemente la mayor epidemia ocurrida en el mundo, la que abrió un nuevo capítulo.2

Las variaciones de los virus del dengue han sido estudiadas por secuenciación nucleotíca de los genes virales. El análisis de una pequeña secuencia genómica permite la determinación de la variabilidad genética y una clasificación geográfica rápida de los aislamientos de dengue. Deubet et al.3 estudiando una zona del gen de la envoltura (aa 22-97) que codifica para un péptido hidrofílico, reportaron 5 grupos genotípicos con menos del 6 % de divergencia nucleotídica. Las secuencias nucleotídicas mostraron cambios significativos entre variantes pertenecientes a un mismo serotipo.

Con el objetivo de obtener el ARN del virus original sin pase en ningún sistema de aislamiento y emplearlo en el estudio de la secuencia nucleotídica y aminoacídica de una zona de gran variabilidad en el genoma del virus dengue 2 que codifica la proteína de la envoltura, y compararla con la secuencia de la primera cepa de dengue 2 (cepa A15) previamente estudiada en esta zona y aislada durante la epidemia de 1981 de un paciente con fiebre del dengue (FD), se estudiaron 14 muestras de suero de la fase aguda de pacientes con FD y FHD conservadas a -70 oC desde el año 1981. A cada una de estas muestras se le realizó extracción de ARN, síntesis de cADN y PCR según Deubel et al.3 usando un par de cebadores específicos para el serotipo 2; considerando que este serotipo fue el agente causal de esta epidemia (22 cepas de dengue 2 fueron aisladas).

La tabla compara los resultados del aislamiento viral con los del PCR. El ARN del virus fue detectado por PCR en 12 muestras. En 7 (58,3 %) de ellas, el virus de dengue 2 fue previamente aislado en 1981 usando ratones lactantes y la línea celular LLCMK2. Este hecho demuestra la mayor sensibilidad del PCR con respecto a los sistemas de aislamiento emplea dos.

La secuencia nucleotídica presente en el suero 49 y la de la cepa A15 son iguales (figura). Este resultado sugiere que al menos en esta zona de alta variabilidad genética no se produjeron cambios en la primera cepa aislada en 1981, a pesar de tener 4 pases en ratón lactante tal cual ha sido reportado por Rico-Hesse.4

Cuando la secuencia nucleotídica fue comparada con la secuencia de otras cepas de dengue 2 (dato no mostrado), ésta mostró gran similitud con cepas viejas de Nueva Guinea, 1944; Tailandia, 1964; Sri Lanka, 1968 y Burma, 1976.5

Este resultado da evidencias adicionales a los previos reportes de similitud de la cepa cubana de dengue 2 con cepas viejas del Sudeste de Asia. Estos factores virológicos y la situación epidemiológica particular de Cuba en 1981 probablemente determinaron la severidad de esta epidemia.

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Lic. Marité Bello. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.