Se normalizó un ensayo de ultramicroELISA de doble anticuerpo para la detección de anticuerpos IgG al virus sincitial respiratorio (VSR), para ello se dispuso de un anticuerpo monoclonal antiproteína F del VSR, producido por el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de La Habana (CIGB). La utilización de este anticuerpo posibilitó la inclusión de preparaciones antigénicas crudas en lugar de fracciones purificadas, lo que disminuye notablemente la reactividad obtenida con el control de antígeno. Las condiciones del ensayo fueron determinadas mediante titulación cruzada y se obtuvo una sensibilidad de 97,2 %, un 91 % de coincidencia y una especificidad 83,3 % del UMELISA con respecto a la fijación del complemento. Los resultados pueden ser expresados cualitativamente o en títulos de anticuerpos empleando una sola dilución de suero (1:40) y una curva patrón.
Palabras clave: ELISA/normas; VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO HUMANO/inmunología; IGG/sangre; ANTICUERPOS ANTIIDIOTIPOS/sangre; ANTICUERPOS MONOCLONALES/inmunología.
El virus sincitial respiratorio (VSR) es el patógeno más importante del tracto respiratorio bajo en lactantes y niños pequeños, con una morbilidad considerable en estas edades y a la vez constituye una causa frecuente de hospitalización,1 por lo que los métodos de diagnóstico rápido son de gran utilidad para la aplicación de una terapia adecuada.2 El diagnóstico serológico de esta entidad nosológica se realiza en nuestro país por la técnica de fijación del complemento (FC), de procesamiento engorroso y sensibilidad baja comparado con otros sistemas diagnósticos.
Conociendo las ventajas mostradas por la aplicación del sistema ultramicroanalítico en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas,3 nos propusimos normalizar un ultramicroELISA (UMELISA) de doble anticuerpo modificado para la detección de anticuerpos IgG al VSR. Para ello se utilizó un anticuerpo monoclonal antiproteína F producido por el Centro de Ingenieria Genética y Biotecnología (CIGB), de La Habana, Cuba y gentilmente donado por el doctor Gavilondo. Este anticuerpo aportó como ventaja al montaje del sistema la inclusión de preparaciones antigénicas crudas, en lugar de fracciones purificadas, lo que disminuye notablemente la reactividad obtenida mg/mL, la dilución de los sueros controles 1:40 y el conjugado con fostasa alcalina 1:1 000. Se seleccionó como valor de corte 0,3 después del análisis de un panel de 50 monosueros de niños evaluado por la técnica de referencia del laboratorio (FC´).
El ensayo fue comparado con las técnicas de FC´ e inmunofluorescencia indirecta (IFI) utilizando un panel de 101 muestras de sueros procedentes del Plan de Vigilancia Seroepidemiológica de las infecciones respiratorias agudas (IRA). Se obtuvieron 70,29; 71,2 y 75 % de positividad para FC´ IFI y UMELISA, respectivamente. La comparación del UMELISA con la FC´ mostró una sensibilidad de 97,2 %, una coincidencia de 91,1 % y una especificidad de 83,3 %. En este caso se encontraron 9 sueros discordantes los cuales fueron evaluados por IFI, con lo que quedaron solamente 4 sueros, donde se pone de manifiesto una vez más la baja sensibilidad de la FC´ con respecto a otros sistemas de determinación de anticuerpos al VSR.6 El UMELISA con respecto a la IFI presentó una sensibilidad de 100 %, una coincidencia de 96 % y una especificidad de 86,2 % (tabla).
TABLA. Resultados obtenidos en la deteceión de anticuerpos al VSR mediante UMELISA, FC e IFI en 101 monosueros del Plan de Vigilancia Seroepidemiológica de las IRA
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| FC´ | IFI | ||
| UMELISA |
| + | - | + | ]]> - |
| + | 69 | 2 | 72 | 0 | |
| - | 7 | 23 | 4 | ]]> 25 | |
Con el objetivo de lograr la aplicación del ensayo a la cuantificación de anticuerpos IgG al VSR, se construyó una curva patrón (r2 = 0,86) que relacionando el logaritmo de las respuestas de fluorescencia con los títulos de anticuerpos determinados a la dilución 1:40 para un panel de sueros seleccionados, permitió estimar de manera precisa y reproducible el título a punto final (TPF) para cualquier el control de antígeno. Las condiciones óptimas de cada reactivo en el ensayo se determinaron por titulación cruzada y se escogieron aquéllos que permitieron una adecuada discriminación entre los controles de referencia.4,5 Así fue determinado que la concentración óptima del anticuerpo monoclonal en el recubrimiento fue de 10 mg/mL, la concentración de antígeno y control celular fue de 1 muestra de suero sólo con el empleo de esta dilución. Las lecturas de fluorescencia son convertidas automáticamente a TPF mediante la relación:
TPF = Exp (log fluorescencia + Bo)/B1
donde Bo es el intercepto y B1 la pendiente
TPF=Exp (log fluorescencia + 1,5079)/0,62971.
Se garantiza un incremento en el número de muestras que pueden ser procesadas por placa. los resultados obtenidos nos permiten recomendar la integración de este sistema al diagnóstico serológico del VSR, dada su elevada sensibilidad, rapidez de ejecución y bajo costo.
An ultramicroELISA assay of double antibody for the detection of IgG antibodies to the respiratory syncytial virus (RSV) wasstandardized. It was used a RVS antiprotein F monoclonal antibody produced by the Genetic Engineering and Biotechnology Center (GEBC) in Havana. The use of this antibody allowed to include crude antigenic preparations instead of purified fractions, which caused a significant reduction of the reactivity obtained with the antigen control. The assay conditions were determined by crossed titration. It was obtained a sensitivity of 97.2 %, a coincidence of 91 %, and a specificity of 83.3 % of the UMELISA as regards the complement fixation. The results may be qualitatively expressed or by antibody titres using only one serum dillution (1:40) and a pattern curve.
Key words: ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/standards; RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS, HUMAN/immunology; IGG/blood; ANTIBODIES, ANTIIDIOTYPIC/BLOOD; ANTIBODIES, MONOCLONAL/immunology.
Recibido: 27 de diciembre de 1995. Aprobado: 19 de julio de 1996.
Lic. Clara Savón. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
1 Doctora en Ciencias Biológicas. Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Auxiliar. ]]>
2 Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado.