Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil
Laboratorio de Investigaciones del SIDA

Evaluación de un sistema de Western Blot (DAVIH-BLOT) para la confirmación de anticuerpos al VIH-1

Lic. OTTO CRUZ SUI, Lic. MARÍA TERESA PÉREZ GUEVARA, Lic. MARICELA IZQUIERDO MÁRQUEZ,¹ Dra. LEONOR LOBAINA BATELEMY, Dr. IGNACIO RUIBAL BRUNET³ y Dr. ELADIO SILVA CABRERA³

RESUMEN

Se reporta la evaluación del sistema DAVIH-BLOT (Laboratorios DAVIH, Cuba) frente a los paneles de proficiencia enviados al Laboratorio Nacional de Referencia del SIDA, por la Organización Mundial de la Salud (OMS), para el aseguramiento de la calidad en el diagnóstico de anticuerpos al VIH en los años 1989, 1991 y 1993, así como la comparación del sistema con los de las firmas DuPont y Diagnostic Pasteur en un grupo de 467 sueros positivos por ELISA. En el estudio de las muestras de la OMS el sistema demostró ser altamente sensible y específico. Al compararlos con los estuches HIV-1 Western blot IgG versión 1.2 (DuPont Company, EE.UU.) y New LAV-blot 1 (Diagnostic Pasteur, Francia) tuvo una coincidencia del 100 y 97 %, respectivamente.

Descriptores DeCS: WESTERN BLOTTING/métodos; ANTICUERPOS HIV; SERODIAGNOSTICO DEL SIDA; ESTUDIOS DE EVALUACION.

INTRODUCCIÓN

En el diagnóstico de anticuerpos al VIH las pruebas de pesquisaje que se utilizan en la actualidad alcanzan niveles altos de especificidad;^1,2 no obstante, como principio general, cualquier resultado reactivo por estas pruebas debe ser confirmado antes de emitir un diagnóstico definitivo. Existen varios métodos de confirmación, pero el Western Blot (WB) se mantiene como el más empleado.^3-6 El procedimiento tecnológico para la obtención de una prueba de WB es complejo y consta de varias etapas. Esta tecnología se utiliza para el diagnóstico del VIH desde 1984⁷ y en la actualidad es producida por diferentes casas comerciales que incluyen en sus indicadores criterios propios de interpretación. La técnica de WB es más sensible y específica que los ensayos de pesquisaje y requiere del uso de métodos y reactivos bien estandarizados, así como de adecuados criterios de interpretación.⁸ La principal ventaja de esta prueba es que define el patrón de bandas de las proteínas virales estructurales para las cuales tienen reactividad los anticuerpos de un individuo, así brindan una información adicional sobre el estadio de la infección. El propósito de este trabajo es evaluar el WB de Laboratorios DAVIH con paneles de proficiencia y su comparación con los sistemas similares HIV-1 Western Blot IgG versión 1.2 (DuPont Company, EE.UU.) y New LAV blot 1 (Diagnostic Pasteur, Francia).

MÉTODOS

Fueron evaluadas 527 muestras de suero humano, 60 de ellas pertenecientes a los paneles 1 (1989), 2 (1991) y 5 (1993), enviadas por la Organización Mundial de la Salud (OMS) al Laboratorio Nacional de Referencia del SIDA (LNRS) para el aseguramiento de la calidad en el diagnóstico serológico de anticuerpos al VIH 1/2. El resto de las muestras (467) era reactivo según el ELISA "Vironostika" (Organon Teknika, Holanda). Todas las muestras fueron analizadas por el sistema DAVIH-BLOT (Laboratorios DAVIH, Cuba).⁹ De las 467 muestras reactivas por ELISA, 332 fueron seleccionadas al azar y se analizaron por el sistema HIV-1 Western Blot IgG versión 1.2 (DuPont Company, EE.UU.) y las 135 restantes por New LAV blot 1 (Diagnostic Pasteur, Francia). El criterio de interpretación utilizado fue el recomendado por cada fabricante. Los sistemas New LAV blot 1 y DAVIH-BLOT comparten el mismo criterio de positividad de la OMS,¹⁰ que considera una muestra positiva si tiene al menos 2 bandas del gen ENV; y en el de DuPont cuando están presentes las p24, p31 y gp41 o gp120/160. La interpretación se define como positiva (P) si la muestra cumple con los criterios anteriormente señalados, negativa (N) si no hay bandas presentes o sólo aparece la p17, e indeterminada (I) si los perfiles de las bandas no clasifican las muestras como positivas o negativas.

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestra el comportamiento del sistema DAVIH-BLOT frente al panel de sueros de la OMS. De las 60 muestras 21 eran positivas a VIH-1, 4 positivas a VIH-2 y 35 eran negativas. DAVIH-BLOT identificó 20 positi-vas a VIH-1, y 1 de estas muestras fue indeterminada, que no clasificó correctamente por tener un patrón de bandas muy débiles que incluía a p17, p24, p34, gp41, p53, p55 y p68. Las muestras positivas a VIH-1 se clasificaron como indeterminadas. De las 35 negativas, el sistema clasificó 7 como indeterminadas, 1 de ellas fue repetidamente reactiva por ELISA y las 6 restantes no reactivas.

La tabla 2 muestra la comparación de DAVIH-BLOT y DuPont con un 100 % de coincidencia en un grupo de 332 sueros reactivos por ELISA. En la tabla 3, DAVIH-BLOT y New LAV blot-1 coincidieron en un 97 %. Hubo 4 muestras (3 %) con resultados discordantes en las categorías de negativo e indeterminado.

TABLA 2. Comparación entre DABIH-BLOT (Laboratorios DA-VIH, Cuba) y HIV-1 Wester Blot IgG versión 1.2 (DuPont Company, EE.UU.)

TABLA 3. Comparación entre DAVIH-BLOT (Laboratorios DA-VIH, Cuba) y New LAV blot-1 (Diagnostic Pasteur, Francia)

DISCUSIÓN

La evaluación de los paneles de la OMS en el LNRS siguió el algoritmo de la mayoría de los laboratorios para el diagnóstico de anticuerpos al VIH, que involucra una prueba inicial y una repetición de los sueros reactivos por ELISA seguida de una confirmación por Western Blot. Este algoritmo de trabajo resulta altamente sensible y específico. No obstante, se les realizó WB a todas las muestras independientemente del resultado por ELISA. En este panel se reporta 1 muestra con resultado indeterminado según el criterio de la OMS, con un patrón de bandas en el que aparecen p17, p24, p34, gp41, p53, p55 y p68; sin embargo, pudiera ser considerada positiva si se analiza por cualesquiera de los criterios interpretativos descritos por otros autores.¹¹

Estos criterios alternativos propuestos por varios grupos han sido objeto de debate debido a que constituyen una de las principales fuentes de variación en la sensibilidad y especificidad de los sistemas de WB comerciales. Se conoce que los anticuerpos a la p24, proteína principal del gen de antígeno grupo-específico GAG y su precursora la p55, son las primeras proteínas detectadas por WB y tienden a disminuir o desaparecer con la aparición o la progresión de los síntomas clínicos;^4,8,11 por el contrario, los anticuerpos a las glicoproteínas gp160, gp120 y gp41 derivadas del gen ENV pueden detectarse en todas las muestras de los infectados por el VIH, independientemente del estadio clínico en que se encuentren.^4,8,11 El esquema de interpretación propuesto por la OMS es altamente específico para aquellas muestras de pacientes con SIDA, pero la sensibilidad es limitada si aparece una sola banda en ENV como se demuestra en el caso descrito.

Los resultados ambiguos o indeterminados por WB pueden deberse a la reacción cruzada por la infección con otro Retrovirus como el VIH-2 o el HTLV I/II; en nuestro estudio las 4 muestras positivas a VIH-2 resultaron indeterminadas, lo que demuestra la especificidad del sistema DAVIH-BLOT para detectar anticuerpos al VIH-1 y el reconocimiento potencial de reacciones cruzadas con otro Retrovirus.

Por otra parte, se encontró que 7 muestras negativas se clasificaron como indeterminadas por WB y sólo 1 resultó repetidamente reactiva por ELISA, las otras eran negativas. Para las muestras que resulten repetidamente reactivas por ELISA e indeterminadas por WB, la estrategia recomendada es el seguimiento serológico periódico de estos pacientes, ya que pudieran ser individuos en proceso de seroconversión o, como se ha reportado en otros estudios, no tener riesgo de infección por VIH y, sin embargo, mostrar un patrón indeterminado por WB persistentemente.¹² Algunos equipos de trabajo han establecido grupo de clasificación para las muestras indeterminadas en diferentes categorías;^13,14 con esta estrategia se reducen el número de sujetos que necesita el seguimiento y el tiempo requerido para determinar si el paciente está en proceso de seroconversión o si mantiene el patrón indeterminado por WB. Los resultados indeterminados por WB en muestras con ELISA no reactivo han sido reportados por otros autores¹² en una población de donantes de sangre con una proporción de hasta 15 %. Afortunadamente, muchos de los indeterminados por WB resultan negativos por ELISA como se demostró en nuestro caso; no obstante, el origen de esta reactividad queda aún por esclarecer.

Los resultados discrepantes por WB cuando se comparan diferentes sistemas pueden ser diversos. La variabilidad en nuestro caso estuvo dada en las categorías de negativo e indeterminado, y coincidimos con otros autores¹⁵ en que pudiera deberse fundamentalmente a las diferentes líneas celulares de cultivo del virus, así como las cepas antigénicas empleadas, entre otras posibilidades. En conclusión, los resultados fueron satisfactorios tanto frente a las muestras de los paneles de la OMS, como en su comparación con los estuches comerciales similares, lo que permite recomendar su uso como prueba confirmatoria de anticuerpos al VIH-1 en el contexto de programas de vigilancia y control de la infección por este virus.

SUMMARY

It is reported the evaluation of the DAVIH-BLOT system (DAVIH Laboratories, Cuba) against the proficiency panels sent to the National AIDS Reference Laboratory by the World Health Organization (WHO) in order to ensure the quality in the diagnosis of HIV antibodies during 1989, 1991 and 1993. The system is also compared with those of the Dupont and Diagnostic Pasteur firms in a group of 467 positive sera by ELISA. On studying the WHO's samples, the system proved to be highly sensitive and specific. In the comparison made with the HIV-1 Western Blot IgG version 1.2 (Dupont company, USA) and with the LAV-blot 1 (Diagnostic Pasteur, France), there was a coincidence of 100 and 97 %, respectively.

Subject headings: BLOTTING WESTERN/methods; HIV ANTIBODIES; AIDS SERODIAGNOSIS; EVALUATION STUDIES.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Dodd RY, Fang CT. The Western immunoblot procedure for HIV antibodies and its interpretation. Arch Pathol Lab Med 1990;114:240-5.
2. Blomberg J, Klasse PJ. Specificities and sensitivities of three systems for determination of antibodies to human immunodeficiency virus by electrophoretic immunoblotting. J Clin Microbiol 1988;26(1):106-10.
3. Schupbach J, Popovic M, Gilden RV, Gonda MA, Sarngadharan MG. Serological analysis of a subgroup of human retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS. Science 1984;224:503-5.
4. Esteban JI, Shih JW, Tai CC, Bodner AJ, Kay JW, Alter HJ. Importance of Western blot analysis in predicting infectivity of anti HTLV-III/LAV positive blood. Lancet 1985;2:1083-6.
5. Fang CT, Darr F, Kleinman S, Wehling RH, Dodd RY. Relative especificity of enzyme linked immunosorbent assays for antibodies to Human T cell lymphotropic virus type III, and their relationship to Western blotting. Transfusion 1986;26:208-9.
6. Center for Disease Control. Testing for antibodies to human immunodeficiency virus type 2 in the United States. MMWR 1992;41:1-9.
7. Sarngadharan MG, Popovic M, Bruch L, Shupbach J, Gallo RC. Antibodies reactive with human T-lymphotropic retroviruses (HTLV-III) in the serum of patients with AIDS. Science 1984;224:506-8.
8. Lundberg GD. Serological diagnosis of human immunodeficiency virus infection by Western blot testing. JAMA 1988;260(5):674-9.
9. Laboratorios DAVIH. Sistema para la detección de anticuerpos al virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH 1) en suero o plasma. Manual de Instrucciones. La Habana: Laboratorios DAVIH, 1989:1-13.
10. World Health Organization Proposed WHO criteria for interpreting results from Western blot assays for HIV-1, HIV-2, and HTLV-1/HTLV-II. Wkly Epidemiol Rec 1990;65(37):281-8.
11. Constantine NT, Callaham JD, Watts DM. Pruebas para la detección del VIH y control de calidad. Guía personal de laboratorio. Durham,Carolina del Norte: AIDSTECH/Family Health International, 1991:62-6.
12. Kleinman S. The significance of HIV-1 indeterminate Western blot results in blood donor populations. Arch Pathol Lab Med 1990;114:298-303.
13. Downie JC, Howard R, Bowcock B, Cunningham AL. HIV-1 antibody testing strategy: evaluation of ELISA screening and Western blot profiles in a mixed low risk/high risk patient population. J Virol Methods 1989;26:291-304.
14. Healey DS, Maskill WJ, Howard TS, Armstrong VA, Bolton WV, Cooper GJ, et al. HIV-1 Western blot: development and assessment of testing to resolve indeterminate reactivity. AIDS 1992;6(7):629-33.
15. Glassman AB, Sherrill T, Paolini J. Human immunodeficiency virus Western blot tests: comparisons and considerations. Ann Clin Lab Sci 1990;20(5):343-6.

Recibido: 18 de enero de 1996. Aprobado: 27 de noviembre de 1996.

Lic. Otto Cruz Sui. Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil. Laboratorio de Investigaciones del SIDA. Carretera de Tapaste y Ocho Vías, San José de Las Lajas, provincia de La Habana, Cuba.