Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"
Lic. JUDITH MENDIOLA,1 Lic. PEDRO CASANOVA,2 Lic. HILDA HERNÁNDEZ,1 Lic. AYMÉ FERNÁNDEZ-CALIENES3 y Téc. ISRAEL GARCÍA4
En el presente trabajo se determinó la concentración de inmunoglobulina G en extractos de intestino de hembras de Boophilus microplus repletas durante los 7 primeros días de la segunda fase de digestión continua, mediante la técnica de inmunodifusión radial simple. Se midió también la concentración de hemoglobina por métodos espectrofotométricos. El análisis de correlación entre ambas variables durante el estudio fue positivo y significativo para p < 0 ,05. El análisis de varianza simple y la aplicación de la prueba de Duncan resultaron en una disminución significativa de las concentraciones de hemoglobina en el intestino a partir del 5to. día de estudio, lo cual se relaciona con el comienzo del proceso activo de oviposición; así como una reducción significativa de la concentración de inmunoglobulina a partir del 7mo. día de estudio. Aunque se evidencia la tendencia a la disminución de la concentración de ambas proteínas sanguíneas, no se pudo producir in vitro la proteólisis de la IgG por extractos de intestino.
Descriptores DeCS: IGG/análisis; INTESTINOS/química; HEMOGLOBINAS/análisis; GARRAPATAS/química; DIGESTION; BOVINOS; INMUNODIFUSION/métodos.
Los artrópodos hematófagos son causantes de grandes problemas a la salud humana y a la animal. La garrapata Boophilus microplus es una parásito del ganado bovino de gran importancia en América Central y del Sur, Asia, Australia y África, el cual provoca grandes daños por las altas infestaciones por sí mismas y por la transmisión de anasplasmosis y babesiosis.
El principal método de control de las infestaciones por garrapatas ha sido el tratamiento de hospederos y de su entorno con acaricidas químicos. El enfásis reciente sobre la protección del medio ambiente y de los alimentos, así como la emergencia de cepas de garrapatas resistentes a los acaricidas han llevado al desarrollo de métodos alternativos de control; por lo que la inmunización protectora de hospederos con antígenos de tejidos de garrapatas y otros artrópodos hematófagos está ganando cada vez mayor atención.1-5
Los daños sobre las garrapatas que produce la inmunización con antígenos de intestino parece estar mediada fundamentalmente por la inmunidad de tipo humoral, ya que se ha establecido una correlación significativamente positiva entre los niveles de anticuerpos contra Ag de membranas intestinales y la protección.6-8 En ensayos de alimentación in vitro con el suero de animales protegidos, se demostró que la IgG más que la IgM produjo el daño en los intestinos de las garrapatas y que la IgG1 más que la IgG2 fue responsable de estos resultados.9
La profundización en el conocimiento de los procesos digestivos y del destino de los anticuerpos en el intestino es de gran relevancia en la eficacia de estas vacunas.10 Se conoce muy poco acerca de la bioquímica de la digestión en las garrapatas, aparte de la conversión de hemoglobina en hematina.11 Son frecuentes los estudios del contenido intestinal de hemoglobina a través de la digestión en garrapatas repletas;12-15 sin embargo, no ha sido así con otros componentes de la sangre y especialmente con aquéllos relacionados con la función inmune. Papatheodorou y Brossard estudiaron la evolución de C3 en el intestino de garrapatas cultivadas sobre animales inmunes y no inmunes.16
En el presente trabajo se estudió la variación en la concentración de IgG bovina en extractos del contenido intestinal de hembras de Boophilus microplus repletas durante los 7 primeros días de la segunda fase de digestión continua, con el objetivo de estimar la retención de inmunoglobulinas potencialmente efectoras dentro de la ingesta aún no digerida durante este período.
Se utilizaron garrapatas hembras repletas y colectadas sobre el bovino después de su repletamiento, con peso promedio de 200 mg, mantenidas a 26 EC y humedad ambiental. Se seleccionaron al azar, por día de estudio 5 garrapatas, cuyos intestinos fueron disectados y cada uno homogeneizado después de la adición de 0,2 mL de salina 0,15 M y centrifugado a 10 000 gravedades x 15 min a 4 EC. Los sobrenadantes de estos homogenatos fueron conservados a -70 EC. Se preparó, además, un homogenato de estómagos en forma similar a la previamente descrita para los ensayos de actividad proteolítica.17
]]> La IgG fue purificada según el método descrito por Butler;18 se comprobó su pureza por electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de duodecil sulfato de sodio (SDS)19 y se determinó su concentración por los métodos espectrofotómetricos;18 de Lowry y otros20 y del ácido bincinconínico.12 Esta IgG fue usada como reactivo patrón y como inmunógeno para la obtención del antisuero anti-IgG (molécula completa).Para la obtención del antisuero se utilizaron 2 conejos chinchilla de 2,5 kg de peso, los cuales fueron inoculados con 30 mg de IgG en 1 mL de PBS por vía subcutánea, junto a adyuvante completo de Freund. Las 2 inoculaciones subsiguientes se realizaron por la misma vía a intervalos de 10 d en cantidades de 25 y 15 mg, respectivamente, con adyuvante incompleto de Freund. Veinte días después de la última inoculación se aplicó una inyección intravenosa con 15 mg de IgG y 10 d después se realizó la extracción de sangre final. La especificidad del antisuero fue comprobada por inmunoelectroforesis mediante la comparación de arcos de precipitación producidos frente a IgG purificada y suero bovino.18
La concentración de IgG en las muestras de contenido intestinal se determinó mediante la técnica de inmunodifusión radial simple.22 En esta prueba se utilizaron 15 mL del antisuero por mL de gel de agarosa al 1 % disuelto en buffer trisbarbiturato, pH 8,6 y polietilenglicol al 3 %. Esta mezcla se virtió en una placa de vidrio formando una capa de 1,5 mm. Las muestras en estudio fueron diluidas 1:16 con el mismo buffer y se depositaron en pocillos uniformes, en cantidades de 5 mL. La incubación se realizó en una atmósfera húmeda a 4 EC durante 24 h. Se realizó una curva estándar de referencia que usaba como patrón IgG bovina a las concentraciones de 82, 164, 328 y 656 mg/mL. El logaritmo de la concentración de IgG es proporcional al diamétro del anillo (media de 2 determinaciones), el cual fue medido en un microscopio estereoscópico armado de un ocular con una escala insertada y calibrada previamente.
La concentración de hemoglobina se midió por el método espectrofotométrico basado en la conversión de hemoglobina en cianometahemoglobina según el procedimiento descrito por O'Hagan.14
La incorporación de la IgG a los procesos proteolíticos que ocurren durante la digestión intracelular en las garrapatas, fue analizada in vitro mediante la incubación de IgG bovina durante 24 h a 37 EC, a pH óptimo de 3,0 y con diferentes concentraciones del extracto enzimático. Comparativamente se realizaron los mismos ensayos con hemoglobina bovina. Se utilizaron 10 mL de IgG bovina/Hb a 10 mg/mL; 10 mL de buffer citrato-fosfato pH 3,0; 10 mL de extracto enzimático y 10 mL de agua destilada, que al término de la incubación fueron mezclados con 20 mL de buffer para la muestra (Tris-HCL 25 mM, pH 6,8; SDS 3 %; sacarosa 10 %; azul de bromofenol 0,05 %) y calentados durante 3 min. Se realizaron controles en los cuales el extracto enzimático se adiciona después del buffer para la muestra. Fueron analizados 5 mL de cada mezcla mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de duodecil sulfato de sodio. Los geles fueron teñidos con azul de Coomassie. La intensidad de las bandas de proteína en los controles fue comparada con la de las bandas de proteína después de la incubación con el extracto enzimático.
Se realizó el análisis de la relación entre los contenidos de hemoglobina e inmunoglobulina mediante el coeficiente de Pearson, previa determinación de la distribución normal de ambas variables según la prueba de bondad de ajuste de Kolmogorov-Smirnov. Se realizó un análisis de varianza simple de cada variable para los días de estudio y se determinó cuáles medias diferían mediante la prueba de Duncan.
La figura 1 muestra la curva patrón para la difusión radial de IgG en presencia del antisuero preparado para su precipitación específica. La ecuación que describe esta curva fue utilizada para la determinación de la concentración de IgG en las muestras de contenido intestinal.
FIGURA 1. Curva patrón para la difusión radial de IgG. Se presentan valores de la media y desviación estándar de 7 determinaciones independientes realizadas por duplicado. Log C = 0,315 (D-Do) + 1,68; r = 0,993; p< 0,001.
El análisis de correlación entre las concentraciones de IgG y hemoglobina en cada muestra, a lo largo del estudio, fue positivo (r=0,66) y significativo para p <0,05 (figura 2).
]]>
FIGURA 2. Relación entre la concentración de inmunoglobulina G y la concentración de hemoglobina en extractos de intestino de garrapatas estudiadas durante los 7 días posteriores a su repletamiento. r= 0,66; p<0,05; r2 = 0,4349; n= 35; p< 0,001.
Se encontró una disminución significativa de las concentraciones de hemoglobina en el intestino a partir del 5to. día de estudio y una reducción significativa de las concentraciones de inmunoglobulinas a partir del 7mo. día de estudio; según el análisis de varianza realizado y la aplicación de la prueba de Duncan (figura 3).
FIGURA 3. Análisis independiente de los valores de las medias de las concentraciones de IgG y hemoglobina en cada día de estudio. Los días que presentan valores de la media que difieren significativamente (p<0,05) se señalan con letras diferentes.
El análisis de la proteólisis in vitro por las enzimas intestinales ácidas dio resultados diferentes para IgG y hemoglobina (figura 4). Mientras que al término de la incubación con 2,5 mg/mL del extracto crudo de intestino prácticamente se ha digerido toda la hemoglobina, la IgG permanece sin mostrar signos de proteólisis, incluso de tipo limitado.
FIGURA 4. a) Proteólisis de hemoglobina bovina con extractos de intestino de Boophilus microplus a las concentraciones de 0,625 mg/mL (1); 1,25 mg/mL (3) y 2,5 mg/mL (5); controles (2),(4),(6). b) Incubación de IgG bovina a las mismas concentraciones. Leyenda como en a).
La digestión de la sangre en las garrapatas difiere de la de los insectos hematófagos. Mientras en estos últimos, la digestión ocurre extracelularmente, en el lumen del intestino en las garrapatas éste es un proceso intracelular lento.11 Esto determina que la ingesta deba ser incorporada a la célula mediante procesos de endocitosis. En ixódidos, la sangre lisada es transportada por medio de la endocitosis en fase fluida, la cual se considera un mecanismo generalmente no selectivo.11 La correlación positiva y significativa que hemos encontrado en este trabajo entre las concentraciones de hemoglobina e IgG a lo largo del proceso digestivo se corresponde con la presencia de este tipo de mecanismo endocitócico. Algunas diferencias en la proporción de los cambios de las concentraciones de Hb e IgG durante el estudio puderan ser el resultado del uso de técnicas de cuantificación diferentes para las 2 sustancias.
En nuestro estudio, la concentración de hemoglobina se redujo al 50 % el 5to. día después del repletamiento lo que coincide con la aparición de las primeras puestas de huevos. La digestión de hemoglobina parece estar relacionada con la longitud variable del proceso de preoviposición. Cuando la temperatura y la humedad se mantienen constantes, la duración del proceso de preoviposición es un tiempo fijo en Dermancentor variabilis y Rhipicephalus sanguineous, mientras el período de oviposición varía entre los individuos.23 Estudios en estas mismas especies encontraron que se digiere aproximadamente la mitad de la hemoglobina al término del período de preoviposición, de modo que la digestión del 50 % de hemoglobina marca el comienzo de la oviposición en diferentes especies de ixódidos.24
]]> La concentración de IgG presentó cambios significativos al 7mo. día de estudio. Consideramos entonces que las inmunoglobulinas que pudieran unirse a antígenos de la garrapata están presentes en el lumen del intestino en cantidades apreciables antes de que se comience el proceso de oviposición. El control de este proceso mediante la afectación de los procesos digestivos ha sido el blanco de las principales vacunas desarrolladas recientemente.25Inmunoglobulinas intactas y funcionales atraviesan el epitelio intestinal y en concentraciones de alrededor de 10-8 M pueden encontrarse en la hemolinfa de las garrapatas.26 Coons y otros11 no encontraron explicación a cómo estas grandes moléculas eran capaces de evitar los procesos digestivos y atravesar una capa epitelial intacta. Nuestros resultados de experimentos in vitro sugieren que las inmunoglobulinas podrían escapar a la digestión debido a la especificidad de las enzimas aspártico-proteinasas encargadas de la digestión intracelular de la hemoglobina.
La actividad efectora de la IgG por la fijación del complemento o de la citotoxicidad mediada por células pusiera ser afectada por la proteólisis de la molécula. Esta proteólisis no ocurrió a pH ácido ni a pH igual a 6,0 o más, como fue descrito con anterioridad.17
La IgG no digerida pudiera ser acumulada junto a otros materiales no aprovechables en los cuerpos residuales,11 pudiera ser transportada hacia el hemocele para intervenir en los procesos de osmorregulación27 o, como ha sido descrito recientemente, la existencia de proteínas de unión a la IgG en la glándula salival y hemolinfa permiten la expulsión de esta proteína foránea como parte de un mecanismo de escape o defensa del parásito.28
Para lograr una protección óptima contra las infestaciones por garrapatas, se ha planteado como estrategia hacer al intestino más permeable a los anticuerpos y dirigir éstos hacia antígenos cruciales de órganos vitales internos.29 Los resultados de este estudio apuntan hacia que la IgG es incorporada al proceso digestivo, pero no es hidrolizada por las principales enzimas del epitelio; por lo que continuar el estudio de las rutas metabólicas de esta inmunoglobulina puede proveer información de gran importancia para los propósitos de lograr una mayor protección contra las infestaciones producidas por Boophilus microplus.
In the present paper it was determined the concentration of immunoglobulin G in extracts from gut of female Boophilus microplus engorded during the first 7 days of the second stage of continual digestion by using the simple radial immunodiffusion technique. It was also measured the concentration of hemoglobin by spectrophotometric methods. The analysis of correlation between both variables made during the study was positive and significant for p < 0.05. The analysis of simple variance and the application of Duncan's test resulted in a marked reduction of the concentrations of hemoglobin in the gut from the 5th day of study, which is connected with the beginning of the active process of oviposition, and in an important decrease of the concentration of immunoglobulin from the 7th day of the study. Though there is a trend to diminish in the concentrations of both blood proteins, the proteolysis of the IgG by gut extracts could not be produced in vitro.
Subject headings: IGG/analysis; INTESTINES/chemistry; HEMOGLOBINS/analysis; TICKS/chemistry; DIGESTION; CATTLE; IMMUNODIFFUSION/methods.
Recibido: 5 de marzo de 1997. Aprobado: 11 de abril de 1997.
Lic. Judith Mendiola. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.
]]>