Determinación de la resistencia a insecticidas y sus mecanismos bioquímicos en 2 cepas de Culex quinquefasciatus procedentes de Santiago de Cuba

Lic. MARÍA M. RODRÍGUEZ,¹ Lic. JUAN BISSET,² Lic. ILEANA RODRÍGUEZ³ y Lic. CRISTINA DÍAZ⁴ 

1. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).
2. Licenciado en Biología. Investigador Auxiliar. IPK.
3. Licenciada en Biología. Centro de Higiene y Epidemiología de Santiago de Cuba.
4. Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora. IPK.

RESUMEN

Se analizó el comportamiento de la resistencia a 3 insecticidas organofosforados (malatión, clorpirifos y pirimifos metil), 3 piretroides (deltametrina, lambdacialotrina y cipermetrina) y 1 carbamato (propoxur) en poblaciones de Culex quinquefasciatus provenientes de 2 municipios de la provincia de Santiago de Cuba. Los valores del factor de resistencia determinaron que existe resistencia para malatión y clorpirifos. Sin embargo, a pesar de la existencia de una alta frecuencia en los mecanismos de esterasas elevadas y acetilcolinesterasa alterada, no se observó resistencia a pirimifos metil, lo cual corroboró la no afectación de este insecticida por estos mecanismos seleccionados en nuestras poblaciones de Culex quinquefasciatus. Se observó resistencia a los insecticidas piretroides deltametrina y lambdacialotrina en Santiago de Cuba, y moderada para cipermetrina en Santiago y San Luis; también se encontró en San Luis resistencia a deltametrina, pero moderada a lambdacialotrina. Los resultados obtenidos a partir del uso de los sinergistas S,S,S tributil fosfotritiado (DEF) y piperonil butóxido (PB) indicaron que los mecanismos de resistencia de esterasas inespecíficas y las oxidasas de función múltiple están involucradas en la resistencia a piretroides en ambas cepas provenientes de Santiago de Cuba y San Luis. Se determinó, mediante las pruebas bioquímicas, que existió una alta frecuencia de los mecanismos de esterasas y acetilcolinesterasa alterada. Los resultados de las electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), mostraron que la esterasa B1 aparece con mayor frecuencia asociada con las esterasas A6 y B6. Se infirió que esta asociacioón pudiera estar vinculada con la resistencia a piretroides.

Descriptores DeCS: INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS/farmacología; CULEX/efectos de drogas; RESISTENCIA A INSECTICIDA/genética; CONTROL DE MOSQUITO/métodos; LARVA/enzimología; LARVA/efectos de drogas; ESTERASAS/genética; ACETILCOLINESTERASA/genética.

Los insecticidas han contribuido a mejorar la producción agrícola en todo el mundo y a disminuir las enfermedades que generalmente se adquieren o transmiten por vectores; pero su utilidad ha sido limitada por la aparición de la resistencia en muchos insectos, los cuales han desarrollado mecanismos contra el efecto tóxico de estos compuestos. Desde el primer caso reportado de resistencia al DDT en 1947, ésta se ha generalizado a insecticidas organofosforados, carbonatos y piretroides.¹

El uso prolongado y sostenido de malatión durante la campaña de erradicación del mosquito Aedes aegypti (Linneaus) favoreció el reemplazo de este mosquito por otro no menos peligroso (Culex quinquefasciatus) en zonas urbanas.² Culex quinquefasciatus Say, 1823, es un importante vector de la filariasis de Bancrofti; y desempeña una función importante en la transmisión de algunas encefalitis.³ Es uno de los mosquitos que mejor se ha adaptado a las más diversas condiciones y modalidades del hábitat humano.⁴

Teniendo en cuenta que Culex quinquefasciatus es actualmente la especie de mosquito más abundante en nuestro país, lo que ocasiona grandes molestias tanto al hombre como a los animales, y puede convertirse en un vector real de filariasis, es necesario extender y llevar a cabo investigaciones que permitan conocer el estado de la resistencia a insecticidas en uso y alternativos, y los mecanismos de resistencia, con vistas a elaborar estrategias que permitan evitar o dilatar la aparición de la resistencia, éste será el objetivo de nuestro trabajo en 2 municipios de la provincia de Santiago de Cuba (San Luis y Santiago de Cuba).

MÉTODOS

Se utilizaron mosquitos de las cepas siguientes:

• San Luis: una cepa de Culex quinquefasciatus obtenida en 1994 en Arroyo Naranjo (ubicado en el municipio San Luis) y mantenida en el Laboratorio sin presión de selección.
• Santiago de Cuba: una cepa de Culex quinquefasciatus obtenida en 1994 del Río San Juan, ubicado en el municipio Santiago y mantenida en el laboratorio sin presión de selección.
• Bleuet: una cepa susceptible de Culex pipiens pipiens procedente de Francia.
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En los bioensayos se emplearon 5 réplicas de cada concentración del insecticida (20 larvas por réplica), se registró entre 2 y 98 % de mortalidad. Todas las soluciones se ajustaron con acetona a un volumen final de 1 mL. Esta concentración de acetona no causó mortalidad en los controles.

La acción de los sinergistas se determinó exponiendo las larvas a concentraciones subletales de S,S,S tributil fosfotritiado (DEF = 0,4 mL de 0,01 %) y de piperonil butóxido (PB = 0,8 mL de 0,001 %) durante 4 h previo a la adición de los insecticidas. La lectura de las mortalidades se realizó a las 24 h, se hallaron la CL₅₀ y la CL₉₀ mediante el programa probitlog.⁵

Las pruebas bioquímicas se realizaron en larvas de cuarto estadio, las muestras fueron homogenizadas en 200 FL de buffer fosfato (0,02 M; pH 7,5) a 4 EC de temperatura. Se determinó la actividad de la acetilcolinesterasa (AchE) normal e inhibida con propoxur según el método de Hemingway y otros.⁶

La actividad de las esterasas se determinó individualmente en larvas según el método de Peiris & Hemingway.⁷

Se determinó en ambos casos la frecuencia de los genes de la resistencia según la fórmula de equilibrio de Hardy-Weinberg.

Se realizó electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) para la identificación de las esterasas, no se utilizó gel concentrador, sólo un gel de corrida de 7,5 %. Se aplicaron 10 FL de muestra + 10 FL del marcador xilen cianol (100 FL de 0,01 % en sacarosa 15 %). La corrida se realizó a 200 volts durante 1h, aproximadamente. Para la tinción se sumergieron los geles en 50 mL de buffer fosfato que contenía 4 mL de cada uno de los sustratos inespecíficos de las esterasas (a-naphtyl acetato y de b- naphtyl acetato) y se le añadió 0,5 g del colorante fast-blue RR. El gel se sumergió en ácido acético al 10 % para fijar la coloración de las bandas.

RESULTADOS

La tabla 1 muestra los valores de los factores de resistencia de las cepas Santiago de Cuba y San Luis para 3 insecticidas organosfosforados, 1 carbamato (propoxur) y 3 piretroides, aplicados a larvas de Culex quinquefasciatus. Según se muestra, el mayor factor de resistencia (FR), calculado a partir de la CL₅₀ y CL₉₀, se obtuvo para malatión, con un valor de 61,0x-104,8x en Santiago de Cuba y 38,2x-93,3x en San Luis, se evidencia que aún persiste la resistencia a este compuesto debido a su extensivo uso durante 6 años; seguido de clorpirifos con 23,0x-14,3x y 19,2x-19,3x; no se detecta resistencia para pirimifos metil en ninguno de estos 2 municipios.

TABLA 1. Análisis de regresión Probit Mortalidad vs. Log. de la dosis y factor de resistencia (FR) para 3 insecticidas organofosforados (malatión, pirimifos metil y clorpirifos), 1 carbamato (propoxur) y 3 piretroides (cipermatrina, deltametrina y lambdacialotrina), aplicados a larvas de Culex quinquefasciatus procedentes de 2 localidades de la provincia de Santiago de Cuba
 

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	Localidades
	Santiago de Cuba					San Luis
	CL50		CL90		]]>	CL50		CL90
Insecticidas	mgL	FR	mgL	FR	b**	]]> mgL	FR	mgL	FR	b**
Malatión	4,96	61,0	13,63	104,8	]]> 2,91	3,86	38,2	12,3	93,3	2,14
Clorpirifos	0,011	23,0	0,028	]]> 14,3	3,2	0,0096	19,2	0,038	19,3	2,1
Pirimifos metil	0,134	1,21	]]> 0,387	2,1	2,7	0,0028	0,02	0,012	0,065	2,0
Propoxur	2,086	]]> 7,72	4,33	9,4	4,0	1,37	5,07	2,61	5,67	4,5
Cipermetrina	]]> 0,004	4,66	0,018	9,05	2,0	0,0027	3,0	0,018	9,0	1,5
]]> Deltametrina	0,0045	15,0	0,011	27,5	3,17	0,0028	9,33	0,012	29,2	]]> 2,0
Lamdacialotrina	0,0018	18,1	0,008	40,0	1,9	0,0005	5,0	0,0017	]]> 8,5	2,5

b**: valores de la pendiente de la línea probit, los cuales indican la homogeneidad relativa de los datos.

En relación con los piretroides, se observó resistencia en Santiago de Cuba tanto a lambdacialotrina como a deltametrina, con patrones de resistencia de 18,1x-40x y 15x-27,5x; respectivamente. También se observó resistencia a deltametrina en San Luis. En ambos municipios se observó resistencia moderada a cipermetrina con valores de FR de 3,0x-9,0x en San Luis y de 4,66x-9,05x para Santiago de Cuba. Igualmente se encontró resistencia moderada a lambdacialotrina en San Luis, lo que señala que hay que mantener la vigilancia de estos insecticidas a fin de implementar medidas que contrarresten la resistencia.

Los valores del factor de resistencia para el propoxur indicaron una vigilancia estrecha tanto para Santiago de Cuba, con un valor de 7,72x-9,4x, como para San Luis, con un valor de 5,07x-5,67x.

Para determinar in vivo si las enzimas esterasas y oxidasas de función múltiple generan resistencia a los insecticidas piretroides (deltametrina, cipemetrina y lambdacialotrina), se utilizaron 2 sinergistas: el DEF (inhibidor de las esterasas) y el PB (inhibidor de las oxidasas de función múltiple).

En las figuras 1 y 2 se muestra el efecto de la acción de los sinergistas DEF y PB, respectivamente, en la cepa Santiago de Cuba, lo cual fue demotrado comparando el factor de resistencia calculado a partir de la CL₅₀ obtenida para los piretroides empleados, sin aplicar sinergistas y con su aplicación.



FIGURA 1. Efecto del S,S,S tributil fosforotritiado (DEF) sobre la respuesta en Culex quinquefasciatus de Santiago de Cuba a los insecticidas piretroides cipermetrina, deltametrina y lambdacialotrina.

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FIGURA 2. Efecto del piperonil butóxido (PB) sobre la respuesta en Culex quinquefasciatus de Santiago de Cuba a los insecticidas piretroides cipermetrina, deltametrina y lambdacialotrina.

En las figuras 3 y 4 se muestran los efectos del DEF y del PB en la cepa San Luis de Cx. quinquefasciatus, de igual forma se comparan los FR sin y con sinergistas. Se evidenció la acción sinérgica de estos compuestos (DEF y PB) al reducir los valores de FR para deltametrina, cipermatrina y lambdacialotrina, tanto en Santiago como en San Luis, esto nos indicó que tanto las esterasas como las oxidasas de función múltiple desempeñaron una función importante en la resistencia a estos insecticidas; es de destacar que el insecticida menos afectado con el DEF resultó ser la cipermetrina, lo cual demostró que las esterasas no son tan importantes en la resistencia a este piretroide, en comparación con deltametrina y lambdacialotrina.



FIGURA 3. Efecto del S,S,S tributil fosforotritiado (DEF) sobre la respuesta en Culex quinquefasciatus del municipio San Luis a los insecticidas piretroides cipermetrina, deltametrina y lambdacialotrina.



FIGURA 4. Efecto del piperonilbutóxido sobre la respuesta en Culex quinquefasciatus del municipio San Luis a los insecticidas piretroides cipermetrina, deltametrina y lambdacialotrina.

Las esterasas se observaron a alta frecuencia (1,0) en ambas cepas; además, se encontró el mecanismos de la acetilcolinesterasa modificada en ambas cepas, con valores también altos de 0,87 en Santiago de Cuba y 0,745 en San Luis.

En la tabla 2 se muestran las frecuencias genotípicas correspondientes a las esterasas B1, A6 y B6 observadas en las cepas de Santiago de Cuba y San Luis. Estas esterasas se encontraron combinadas indistintamente. Como se muestra en la tabla existen 3 combinaciones de enzimas, son ellas: B1, B1-A6-B6 y B1-B6, donde la combinación de esterasa B1-A6-B6 es la que desempeña una función importante en la resistencia a insecticidas, tanto en la cepa de Santiago de Cuba como en la de San Luis, ya que es la que aparece con mayor frecuencia, con valores de 0,62 y 0,466; respectivamente; aunque la esterasa B1 es fundamental, pues está presente siempre, ya sea combinada con A6 ó B6 y aparece también sin asociarse a las otras esterasas con una frecuencia altamente relativa, como es el caso de San Luis.

TABLA 2. Valores de frecuencia para cada uno de los genotipos de esterasas B1, B6, A2, A6 y las combinaciones en que aparecen en las cepas de Culex quinquefasciatus de Santiago de Cuba y de San Luis

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	Frecuencias genotípicas
Cepas	B1	B1A6B6	B1B6	B1A6	A2B1	]]> A2B1A6B6	Total
Santiago de Cuba	0,08	0,62	0,29	0	0	0	96
]]> San Luis	0,333	0,466	0,2	0	0	0	96

DISCUSIÓN

El incremento de los casos de resistencia a insecticidas organofosforados, principalmente a malatión, están bien documentado en nuestro país, tanto en condiciones de campo como en investigaciones realizadas al nivel de laboratorio, y se demuestra también en este estudio, realizado con cepas provenientes de la provincia de Santiago de Cuba.

]]> Es conocido que como consecuencia de la aparición de resistencia a malatión, en 1986 este compuesto fue sustituido por insecticidas piretroides para el control de Culex quinquefasciatus, la resistencia a éstos no aparece hasta 1991, lo cual indica que 1 o más factores de resistencia estaban siendo seleccionados en las poblaciones de campo de Culex quinquefasciatus a partir de la resistencia a organosfosforados y carbamatos.⁸ Khayrandish y Wood⁹ cuando trabajaban en una cepa de Culex quinquefasciatus de Tanzania observaron una elevada resistencia a piretroides como resultado de una oxidación, también hallada anteriormente en cepas de California.¹⁰ Además, en estudios realizados por Magnin y otros¹¹ en otras poblaciones como las de Bouake y B-DEL provenientes del oeste de África, encontraron oxidasas que intervenían en la resistencia de deltametrina. Estudios con sinergistas revelaron que las enzimas esterasas elevadas y multifunción oxidasa desempeñaron una función importante en la resistencia a insecticidas organofosforados en Culex quinquefasciatus de Cuba.^12,13

La probable intervención de las esterasas en la resistencia cruzada a piretroides fue señalada por Abernathy y Casida⁴ y Jao y Casida.¹⁵ Según Raymond y otros¹⁶ y Hemingway y otros¹⁷ las esterasas no intervienen en la resistencia a piretroides. Sin embargo, Bisset y otros¹³ determinaron, en estudios con sinergistas, que las esterasas desempeñaron una función importante en la resistencia a deltametrina y a lambdacialotrina en cepas de Culex quinquefasciatus de Ciudad de La Habana.

Kumar y otros¹⁸ plantearon que existe una correlación significativa entre la actividad de la multifunción oxidasa (MFO) y la CL₅₀ larval para la deltametrina, lo que sugiere que la resistencia a este compuesto es fundamentalmente debida a la detoxificación por la MFO microsomal.

Nuestros resultados revelaron que en la resistencia a insecticidas piretroides están involucrados tanto el mecanismo de las esterasas inespecíficas como el mecanismo de la multifunción oxidasa.

Estudios realizados por Curtis y Pasteur¹⁹ en Culex quinquefasciatus de Tanzania confirman que en las poblaciones de este mosquito donde se ha seleccionado el mecanismo de resistencia de las esterasas elevadas, aparece con posterioridad el mecanismo de la acetilcolinesterasa alterada y que cuando existen ambos mecanismos de resistencia en una misma población, el nivel de resistencia que ofrecen es mayor que cada uno por separado.

Villani y otros,²⁰ mediante análisis bioquímicos y ensayos electroforéticos realizados en cepas de Culex quinquefasciatus de Italia, demostraron la selección combinada de los mecanismos de esterasa y acetilcolinesterasa, pero observaron una declinación en la aparición de las esterasas en comparación con la acetilcolinesterasa. Resultados similares obtuvo Rodríguez²¹ en Culex quinquefasciatus de Ciudad de La Habana.

Estudios realizados a escala mundial relacionados con la asociación de varias esterasas electromorfas en especies resistentes a los organofosforados muestran la existencia de estas enzimas: esterasas B1 en Culex quinquefasciatus de Cuba y California,^12,22 esterasas A2 y B2 en California, Sri Lanka y Arabia Saudita en esta misma especie.^16,17 Las esterasas A6 y B6 comenzaron a aparecer en Culex quinquefasciatus en Cuba aproximadamente 4 años después del reemplazo de malatión por piretroides por el Departamento Nacional de Control de Vectores.¹³

Debido a los muchos problemas causados por la resistencia a insecticidas, se han realizado sugerencias para contrarrestarlas, se ha llevado a la práctica la sustitución de un insecticida inefectivo por otro más efectivo, el uso de mezclas de 2 insecticidas de acción independiente, la alternancia de insecticidas por cambio de uno o otro, relacionado esto con el hecho negativo de que la presión de selección con un insecticida determinado aumenta la resistencia de uno pero disminuye la resistencia de otro. Aplicando esto último podemos sugerir con nuestros resultados el uso del insecticida organofosforado pirimifos metil alternado con cipermetrina en ambos municipios de la provincia de Santiago de Cuba y también puede alternarse con lambdacialotrina en San Luis, para de esta forma dilatar la resistencia moderada observada a estos insecticidas piretroides.

SUMMARY

It was analyzed the behavior of the resistance of 3 organophosphated insecticides (malathion, clorpirifos and methyl-pyrimifos), 3 pyrethroids (deltamethrin, lambda-cyhalothrin and cypermethrin), and 1 carbamate (propuxur) in populations of Culex quinquefasciatus from 2 municipalities of the province of Santiago de Cuba. The values of the resistance factor proved that there is resistance to malathion and clorpirifos. However, in spite of the existance of a high frequency of the mechanisms of elevated esterases and altered acetylcholinesterase no resistance to methyl-pymirifos, was observed which demostrated that this insecticide is not affected by these mechanisms selected in our populations of Culex quinquefasciatus. There was resistence to deltamethrin, and lambda-cyhalothrin in Santiago de Cuba, whereas it was moderate to cypermethrin in Santiago and San Luis. Resistance to delta-methrin was also found in San Luis, but it was mild to lambda-cyhalothrin. The results obtained from the use of the synergists S,S,S tributyl phosphotritiade (DBF) and piperonyl butoxide (PB) indicated that the mechanisms of resistance of unspecific esterases and oxidases of multiple function are involved in the resistance to pyrethroids in both strains from Santiago de Cuba and San Luis. It was determined by the biochemical tests that there existed a high frequency of the mechanisms of esterases and altered acetyl-cholinesterase. The results of the polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) showed that esterase B1 appears more frequently associated with esterases A6 and B6. It was inferred that this association coul be connected with the resistance to pyrethroids.

Subject headings: INSECTICIDES, ORGANOPHOSPHATE/ /pharmacology; CULEX/drug effects; INSECTICIDE RESISTANCE/genetics; MOSQUITO CONTROL/methods; LARVA/ /enzymology; LARVA/drug effects; ESTERASES/genetics; ACETYLCHOLINESTERASE/genetics.

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]]> Recibido: 28 de febrero de 1997. Aprobado: 18 de julio de 1997.

Lic. María M. Rodríguez. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.

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