Estudio del patrón de excresión y la capacidad protectora en conejos inmunizados de forma oral con cepas atenuadas de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor

MC. Hilda María García Sánchez,¹ Lic. Luis García Imia,² Téc. Reynaldo Oliva Hernández,³ Lic. José Luis Pérez Quiñoy,⁴ Lic. Bárbara Cedré Marrero,⁵ Téc. Roxana Domínguez Iriarte⁶ y DC. Jorge Benítez Robles⁷

Resumen

El cólera constituye una preocupación emergente para la salud pública en muchas partes del mundo. La aparición de la epidemia de cólera en América Latina y el surgimiento en Asia de una enfermedad causada por Vibrio cholerae O139, la primera cepa serogrupo No-O1 causante de cólera que se ha identificado, indica que esta enfermedad se mantendrá como un problema en los próximos años.1 Ante la imposibilidad de garantizar una atención médica adecuada y condiciones de vida higiénicas para esta gran masa de población, la obtención de una vacuna segura, eficaz y barata contra el cólera, continúa siendo una línea priorizada de la Organización Mundial de la Salud y de muchos laboratorios e investigadores en el mundo.2

En la actualidad se trabaja intensamente en 2 variantes orales de vacunas contra esta enfermedad. Una de ellas, con resultados más alentadores, se basa en la administración oral de cepas vivas de V. cholerae que mediante manipulación genética se les elimina su toxicidad aunque conservan la capacidad de reproducirse y colonizar el intestino. Partiendo de la premisa de que la propia enfermedad confiere una sólida protección y que la capacidad de colonizar el intestino es indispensable para alcanzar una correcta presentación antigénica en la mucosa intestinal, se explican los mejores niveles de protección de esta variante, en estudio en humanos, cuando se compara con la otra variante de células inactivadas por métodos físicos o químicos.3-5

Hasta el momento no existe un modelo animal ideal para evaluar la colonización de V. cholerae, pero el modelo de inoculación oral en conejos adultos puede ser usado para el estudio de inmunogenicidad de cepas candidatas a vacunas vivas orales de V. cholerae. En este modelo es necesario neutralizar la acidez gástrica antes de la inoculación para lograr una buena colonización.6

En nuestro laboratorio se han obtenido cepas vivas atenuadas de V. cholerae O1 desprovistas de la región genómica que codifica para la síntesis de los principales factores de virulencia de este germen. La construcción de estas cepas se realizó a partir de una cepa epidémica de aislamiento clínico en Perú.7

El objetivo de este trabajo fue estudiar los patrones de excreción, colonización y la capacidad protectora de cepas vivas atenuadas de V. cholerae O1 administradas de forma oral en 2 dosis a conejos retados posteriormente con cepas virulentas.

Métodos

Cepas. Las cepas utilizadas fueron C7258 V. cholerae O1 El Tor Ogawa y C6706 El Tor Inaba, aisladas de pacientes en Perú en 1993, y SG 251 V. cholerae No-O1 serogrupo O139 aislada de un paciente en la India; donadas por Ph.D Richard Finkelstein de la Universidad de Missouri, EE.UU.; 81 y 87 V. cholerae O1 El Tor Ogawa (ctxA-, ctxB-, zot, ace-, orfU-, cep-) mutadas por técnicas de ingeniería genética en el Laboratorio de Biología Molecular del Centro Nacional de Investigaciones Científicas, a partir de la cepa C7258. Como control se utilizó la cepa de Escherichia coli K-12 no toxigénica.

Condiciones de cultivo. Las cepas se cultivaron en erlenmeyers de 250 mL con 50 mL de medio caldo triptona soya (TSB), inoculados con 3 mL de un cultivo de 18 h. Se agitó a 200 ciclos/min entre 5 y 6 h a 37 ^oC. Se realizó el conteo de unidades formadoras de colonias (UFC) y la concentración de células se ajustó a 109 UFC/mL.8

Esquema de inmunización. Se retiró el alimento a los animales 12 h antes de la inoculación y luego fueron sedados con pentobarbital intravenoso. La acidez gástrica se neutralizó con cimetidina y bicarbonato de sodio 50 mg/kg de peso y 5 %, respectivamente. Treinta minutos antes de la inoculación se administraron 15 mL de cimetidina y bicarbonato de sodio, y otros 15 mL de este último 15 min antes de la inoculación. Todo esto fue realizado por intubación gástrica. Los inóculos contenían 1 mL de cultivo ajustado a 109 UFC/mL en 14 mL de hidrolizado ácido de caseína, extracto de levadura (CAYE). Luego de la inoculación los animales fueron mantenidos de forma individual y se les restringió el alimento, no así el agua durante las siguientes 12 h.9 Se inmunizó con 2 dosis con iguales concentraciones, espaciadas 28 d.

Aislamiento e identificación

Muestras. Las muestras de heces e hisopado rectal se recogieron a partir de las 6 h posteriores a cada inoculación a intervalos de 3 h durante 1 d, en medio agua peptona alcalina y se incubaron entre 6 y 8 h a 37 ^oC. Los cultivos crecidos se sembraron por agotamiento en medio selectivo tiosulfato citrato sales biliares (TCBS) durante 18 a 24 h a 37 ^oC. Las colonias características de V. cholerae se seleccionaron para pruebas bioquímicas preliminares.10,11

Pruebas bioquímicas de selección. Las colonias características del género Vibrio fueron sembradas por punción y estría en agar hierro y 2 azúcares de Kligler y agar hierro lisina. A los tubos que presentaron las características de Vibrio se les realizaron las pruebas de la oxidasa, cuerda y serología.10

Modelo intestino ligado. Dos semanas después de la segunda dosis los animales inoculados con 2 dosis de las cepas C7258, 81, 87 y K-12, se aclimataron desde 1 semana antes de la operación en el local donde se realizó ésta y a una temperatura entre 22 y 25 ^oC. Los animales no se alimentaron durante las 24 h previas al experimento aunque pudieron beber libremente. Se utilizó como anestésico pentobarbital a razón de 25 mg/kg de peso. Se realizaron ligaduras de alrededor de 5 cm de longitud alternadas con ligaduras de 2 cm; la inoculación se realizó en los segmentos mayores con 0,5 mL de una suspensión de 107 células/mL de las cepas C7258, C6706 y SG251. Luego de la sutura los animales fueron mantenidos durante 18 h en jaulas individuales sin alimentar pero con agua ad libitum. Transcurrido ese tiempo los animales se sacrificaron con una sobredosis de pentobarbital y se efectuó la necropsia. En caso de haber ocurrido acumulación de fluido en los segmentos inoculados se procedió a la determinación de su volumen y UFC. El fluido acumulado (FA) se expresa en mL/cm.12-14

Los fragmentos de intestino se lavaron con PBS, se pesaron y se homogeneizaron en un Ultraturrax 15 seg a 13 500 r.p.m., posteriormente se calculó el número de UFC/mL por gramo de intestino.15

Resultados

En la tabla 1 se presentan los resultados de la identificación de V. cholerae O1, aislada de muestras de heces e hisopado rectal de animales inoculados con 2 dosis de las cepas C7258, 81 y 87 durante las 24 h posteriores a cada una de las inmunizaciones.

TABLA 1. Aislamiento e identificación de Vibrio cholerae O1 El Tor Ogawa en muestras de heces e hisopado rectal de conejos inmunizados oralmente con 2 dosis de 109 UFC

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Cepa	Muestra / Tiempo(h)		1ra. dosis	2da.dosis
		6	+	+
]]>	Heces	12	+	-
		18	+	-
]]> C7258		6	+	+
	Hisopado rectal	12	+	-
]]>		18	+	-
		6	+	+
]]>	Heces	12	+	-
		18	+	-
]]> 81		6	+	+
	Hisopado rectal	12	+	-
]]>		18	+	-
		6	+	+
]]>	Heces	12	+	-
		18	+	-
]]> 87		6	+	+
	Hisopado rectal	12	+	-
]]>		18	+	-

Los animales excretan las cepas inoculadas entre las 6 y 18 h posteriores a la primera inoculación y ya a las 24 h no se logra aislar el microorganismo en las muestras de heces. Después de la segunda dosis, sólo se aísla el microorganismo inoculado en las muestras correspondientes a las 6 h posteriores a la inoculación. Este comportamiento es el mismo si el animal está inoculado con la cepa mutada o con su parental virulento.

Los resultados del estudio de colonización intestinal en el modelo de intestino ligado con cepas altamente virulentas se muestran en la tabla 2. Los niveles de concentración celular de las cepas de reto de ambos serotipos, en intestino lavado y homogenizado, así como el volumen de fluido acumulado (FA), son inferiuores en los animales inoculados, tanto con células atenuadas por manipulaciones genéticas, como en su parentales correspondientes, al compararlos con animales controles no inoculados, eso no ocurre con la cepa de reto del serogrupo O139.

TABLA 2. Cuantificación de Vibrio cholerae ne muestras de fluido acumulado e intestino lavado de conejos inmunizados oralmente con 2 dosis de Vibrio cholerare O1 El Tor Ogawa

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Cepa de inmunización*	Cepa de reto	FA (mL/cm)**	FA (Log UFC/ML)	Intestino***  (Log UFC/g)
]]> C7258*****	C7258	0,03	NC****	NC
	C6706	0,92	2,4 x 108	NC
]]>	SG251	1,39	4,34 x 109	2,3 x 109
81	C7258	0,45	NC	NC
]]>	C6706	0,4	7,2 x 109	NC
	SG251	1,7	6,8 x 109	3,3 x 108
]]> K-12	C7258	1,27	2,5 x 109	3,4 x 109
	C6706	1,28	4,4 x 109	3,0 x 109
]]>	SG251	1,16	7,5 x 109	3,6 X 109

* Animales inoculados con 2 dosis de 108 UFC de V. cholerae O1 El Tor Ogawa o E. coli K-12, los días 0 y 28.

** Fluido acumulado por centímetro de intestino ligado en el modelo Ileal Loop realizado 14 d después de la segunda dosis. Todos los animales están retados con la cepa C7258.

** * Cuantificación de la cepa de reto en fragmentos de intestino lavados con PBS y homogeneizados en un ultraturrax 15 s a 13 500 r.p.m.

*** No crecimiento a la dilución de trabajo (10-4).

Discusión

En los últimos años se han obtenido en el laboratorio y probado en humanos varias cepas de V. cholerae O1 modificadas genéticamente de manera que han perdido parte o la casi totalidad de sus factores de virulencia. Existe un compromiso entre la capacidad de colonizar el intestino por parte de estas cepas, su reactogenicidad y su inmunogenicidad. Es evidente que la capacidad de adherirse y proliferar en la mucosa condiciona las características inmunogénicas del preparado.5,16,17

En el presente estudio se reveló que el patrón de excreción del microorganismo inoculado es el mismo para ambos tipos de cepas, luego de las 2 dosis, lo que evidencia que las manipulaciones genéticas realizadas para la atenuación de la cepa, no afectaron su patrón de excreción (tabla 1). No obstante, posterior a la segunda dosis se observa una excreción del microorganismo sólo en las primeras 6 h lo que refleja que la inmunidad de mucosa adquirida luego de la primera dosis afecta la colonización intestinal y la proliferación del segundo inóculo.

En estudios de inmunogenicidad en humanos de una cepa viva atenuada de V. cholerae O1 (CVD 103 HgR) se han encontrado que, ya sea por una dosis inicial o por inmunidad natural adquirida por contactos previos con el microorganismo, los niveles de colonización intestinal que se alcanzan después de una segunda dosis son más bien bajos.16-18 Este hecho, corroborado en el presente estudio, apoya la posibilidad de alcanzar protección luego de la administración de una dosis única de cepas vivas atenuadas de V. cholerae.

Tanto los animales inoculados con las cepas atenuadas como los que recibieron la cepa salvaje adquirieron niveles apreciables de protección ante el reto realizado por el modelo de intestino ligado con cepas de V. cholerae altamente virulentas, que constituye uno de los modelos más utilizados en la evaluación de la virulencia de V. cholerae. Esto se hace evidente por los valores de fluido acumulado y por el número de UFC por gramo de intestino homogeneizado, diferentes entre los animales inmunizados con ambos tipos de cepas al compararlos con los animales controles inmunizados con la cepa E. coli K-12, no se observa protección cuando se enfrenta con la cepa del serogrupo O139 (tabla 2). Esta cepa V. cholerae No-O1 puede ser considerada el segundo agente causal del cólera, porque provoca una enfermedad que no se diferencia a la ocasionada por V. cholerae O1 ya que comparten algunas características con el serogrupo O1, incluyendo la producción de toxina de cólera.19,20 Basado en datos epidemiológicos, una exposición natural con el serogrupo O1 parece brindar una insignificante o ninguna protección frente a V. cholerae O139.19 Se cree que este nuevo serogrupo puede ser el agente causal de la octava pandemia del cólera.21,22

La aplicación de las cepas vivas atenuadas como vacunas efectivas contra el cólera es en la actualidad una de las variantes más favorecidas en la búsqueda de un preparado vacunal en verdad efectivo contra la enfermedad.16 Las cepas atenuadas 81 y 87 utilizadas en el presente trabajo conservan su patrón de excreción en el modelo del conejo adulto e indujo en la confrontación en intestino ligado, una significativa disminución del número celular de las cepas virulentas de reto y líquido acumulado en los segmentos intestinales; todo ello incrementa la posibilidad de utilizar estas cepas 81 y 87 en estudios preliminares de reactogenicidad e inmunogenicidad en humanos.

SUMMARY

In order to study the excretion patterns, colonization and protective capacity of live sttenuated strains of Vibrio cholerae O1. E1 Tor, rabbits were immunized in New Zealand with these strains and their corresponding parental strains. 2 doses were administered by the model of oral inoculation in adult rabbits. Rabbits were rotated 2 weeks after the second dose by the model of ligated intestine with highly virulent strains of V. cholerae O1 Ogawa and Inaba serotypes and O139 serogroup. It was proved that the genetically manipulated strains do not effect the excretion patterns when they are compared with their parental strains. It was observed in the challenge a decrease in the levels of colonization of virulent strains of both serotypes, not only among the rabbits immunized with the attenuated strains, but also among those immunized with the parental strains in comparison with control animals immunized with the strain of Escherichia coli K-12, which means that there was certain degree of protection. In the case of the animals challenged with the O139 strain it was demonstrated that the protection is specific for each serogroup, since in this case there was no reduction of the colonization.

Subject headings: CHOLERA VACCINE/immunology; VACCINES, ATTENUATED/immunology; VIBRIO CHOLERAE/isolation & purification; RABBITS/immunology; FECES/microbiology; IMMUNIZATION SCHEDULE.

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Recibido: 11 de septiembre de 1996. Aprobado: 12 de diciembre de 1997.

Lic. Hilda María García Sánchez. Instituto "Finlay". Ave. 27, No. 19805, La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba. AP 16017, CP 11600.

1. Master en Ciencias. Bacteriología-Micología. Instituto "Finlay".
2. Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar. Instituto "Finlay".
3. Técnico en Medicina Veterinaria. Instituto "Finlay".
4. Licenciado en Biología. Instituto "Finlay".
5. Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada. Instituto "Finlay".
6. Técnico en Química Industrial. Instituto "Finlay".
7. Doctor en Ciencias Biológicas. Centro Nacional de Investigaciones Científicas.
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