Universidad San Francisco de Quito, Ecuador
Dr. Gabriel Trueba,1 Dra. Sonia Zapata,2 Dr. Kleber Madrid3 y Nicolás Peñafiel4
Se describió un estudio acerca de la adaptación de Leptospira interrogans a medios acuosos carentes de nutrientes. Para este propósito se incubaron leptospiras por período de tiempo indeterminado en agua destilada y en solución salina tamponada. Las leptospiras se mantuvieron viables en agua por 98 d, mientras que, las incubadas en solución salina tamponada sobrevivieron únicamente 3 semanas. Los componentes proteicos celulares y de membrana externa fueron analizados mediante electroforesis en geles de acrilamida (SDS-PAGE). Cuando se compararon los perfiles de proteínas de OM de leptospiras mantenidas en agua, con aquellos perfiles de OM de células cultivadas en medio EMJH, se observaron algunas diferencias. Una proteína de 56 kDa estuvo presente en leptospiras que fueron mantenidas en agua por una semana. Mediante análisis de western blot se identificó a esta proteína como GroEL.
DeCS: LEPTOSPIRA INTERROGANS/aislamiento & purificación; CONTAMINACION DEL AGUA; FACTORES DE RIESGO; MEDIOS DE CULTIVO; LEPTOSPIROSIS/epidemiología; LEPTOSPIROSIS/microbiología; AGUA DULCE.
Las especies patógenas de la espiroqueta Leptospira, se encuentran en la naturaleza asociadas a riñones de animales portadores, principalmente mamíferos.1 Estas bacterias son los agentes causales de una de las zoonosis más difundidas en el mundo, cuyos síntomas pueden ir desde una enfermedad similar a la influenza a una infección hemorrágica potencialmente fatal.
Se ha demostrado que las especies patógenas pueden sobrevivir en agua o suelo húmedo por períodos prolongados de tiempo de 15 a 74 d,2,3 pero muy poco se sabe acerca de la posible capacidad de esta bacteria para multiplicarse en estos medios.
Brotes recientes han puesto de evidencia la importancia del agua dulce como fuente de infección de leptospirosis humana.4-8 El propósito de este estudio fue investigar in vitro, la capacidad adaptativa de Leptospira a la carencia de nutrientes y baja osmolaridad del agua dulce.
Las células bacterianas fueron cosechadas mediante centrifugación bajo similares condiciones a las anteriormente indicadas, las células fueron lavadas 2 veces con solución salina fosfatada. Análisis electroforéticos de perfiles proteicos de toda la célula y de membrana externa fueron llevados a cabo. Para la extracción de membrana externa se utilizó un método publicado anteriormente.9 Las células lavadas fueron resuspendidas en 1 mL de una solución 10 mM deTris (pH 7,4), a lo que se añadió Triton X114 hasta una concentración de 0,1 % y se le permitió reaccionar por 1 h, luego se centrifugó la mezcla a 14 000 g por 30 min, y se aspiró el sobrenadante, que contuvo los componentes de membrana externa. Análisis de western blot fueron llevados a cabo siguiendo el protocolo previamente descrito10 y se utilizaron anticuerpos de conejo contra la proteína GroEL de Escherichia coli (Stressgen Biotechnologies, Canadá )
Las leptospiras incubadas en agua destilada demostraron muy poca alteración, a pesar del cambio osmótico y la carencia de nutrientes a que fueron sometidas. Los conteos bacterianos mostraron en muchas ocasiones incluso elevación en el número de espiroquetas durante la segunda a quinta semana de incubación (fig. 1). La viabilidad (presencia de movilidad giratoria y aparente proceso de división celular) de algunas de estas bacterias fue observada durante 98 d de incubación en agua destilada. Estas espiroquetas mostraron una aparente disminución del volumen celular. Similares resultados se obtuvieron cuando las bacterias fueron incubadas en agua de lluvia estéril. Las espiroquetas incubadas en PBS, mostraron menor vitalidad, las conteos bacterianos disminuyeron en forma drástica (fig. 2) y no se pudieron detectar células viables luego de 3 semanas de incubación. El agua de lagunas no permitió la supervivencia de leptospiras, a pesar de tener un pH que osciló de 7,5 a 8,0. Se observó que la contaminación con ciertas bacterias ambientales destruye rápidamente a las leptospiras (datos no documentados en este escrito).
Fig. 1. Número de leptospiras activas durante incubación en agua destilada pH 7,2.
Fig. 2. Comparación de supervivencia de Leptospira incubada en agua destilada (pH 7,2) y PBS (pH 7,2).
Los estudios electroforéticos de células completas no demostraron en forma consistente la expresión de proteínas durante la incubación en agua. Sin embargo, cuando se analizaron los extractos de membrana externa se pudieron encontrar múltiples diferencias, entre las que se destacó una banda de 56 kDa (fig. 3). El análisis de western blot de las membranas externas y cilindros protoplasmáticos de Leptospira identificó a la proteína de 56 kDa, como proteína GroEL de Leptospira (fig. 4).
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Fig. 3. Perfil de proteínas de membrana externa de células de Leptospira, incubadas en medio de cultivo (CM) y en agua destilada (DW). Las membranas fueron corridas en un gel de acilamida (SDS-PAGE) y teñidas con azul de Coomassie. Los números a la izquierda indican la localización de los estándares de tamaño.
El punto negro indica la localización de la proteína de 56 kDa.
Fig. 4. Análisis de western blot de proteínas de membrana externa y cilindro protoplasmático de Leptospira,
con la utilización de anticuerpo de conejo contra proteína GroEL de Escherichia coli.
La Leptospira patógena es un habitante de los riñones de muchos mamíferos donde la concentración de NaCl es cercana a 0,85 %. Se esperaba, por lo tanto, que las leptospiras sobrevivieran en mejores condiciones en PBS que en agua. Estos resultados sugieren que Leptospira tiene una capacidad especial de adaptación al agua.
Adicionalmente, Leptospira patógena parece tener una capacidad de resistencia a la carencia de nutrientes superior a otros patógenos bacterianos e incluso géneros adaptados al agua como el Vibrio.11 Otros tipos de géneros bacterianos patógenos responden a la carencia de nutrientes produciendo formas vivas, no cultivables,12 sin embargo, Leptospira parece mantenerse activa con motilidad rotativa y cultivable por períodos de tiempo posiblemente superiores a 98 d. La inducción de ciertas proteínas, durante la incubación en agua, podría ser un artefacto causado por choque osmótico durante extracción de membrana externa. La proteína chaperona GroEL normalmente se encuentra en el citosol bacteriano (cilindro protoplásmico), y apareció en el extracto de membrana externa de células incubadas en agua (fig. 4) . ]]>
A Rudy Hartskeerl y Albert Ko por su valiosa ayuda.
Este trabajo es parte del proyecto P-BID 414 financiado por el Banco Interamericano de Desarrollo mediante la Fundación para la Ciencia y la Tecnología (FUNDACYT) del Ecuador.
The contact with polluted waters is one of the main risk factors to catch leptospirosis. A study is presented about the adaptation of Leptospira interrograns to nutrient-lacking water media. For this end, leptospires were incubated in distilled water and tampon saline solution for an undetermined period of time. Leptospires kept viable in water for 98 days whereas the incubated ones in tampon saline solution survived 3 weeks only. Protein cellular and external membrane components were analyzed with electrophoresis in acrylamide gel (SDS-PAGE). When OM protein profiles of leptospires kept in water were compared to those OM profiles of cells cultured in ENJA medium, some differences were observed. A 56 kDa protein was present in leptospires kept in water for a week. This protein was identified as GroEL through Western Blot test.
Subject headings: LEPTOSPIRA INTERROGANS/isolation & purification; WATER POLLUTION; RISK FACTORS; CULTURE MEDIA; LEPTOSPIROSIS/epidemiology; LEPTOSPIROSIS/microbiology; FRESH WATER. ]]>
Recibido: 17 de septiembre de 2001. Aprobado: 15 de noviembre de 2001.
Dr. Gabriel Trueba. Laboratorios de Microbiología. Universidad San Francisco de Quito, Vía Interoceánica, Círculo Cumbayá. Teléfonos 593 2 895-723 extensión 232 y 233.