0375-0760 0375-0760 S0375-07602005000100009 ]]> México 00 04 2005 00 04 2005 57 1 45 46

Índice Anterior Siguiente
REV CUBANA MED TROP 2005;57(1):45-6

Formato PDF

Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México

Expresión en Escherichia coli del gen gspdl del sistema de secreción tipo II de Leptospira borgpetersenii serovariedad hardjo*

Dr. Ernesto Armando Rodríguez Reyes,1 Dr. Paul Cullen,2 Dr. Dieter Bulach,2 Dr. Ben Adler,3 Dr. David Haake4 y Dr. Alejandro de la Peña-Moctezuma5

Resumen

Se clonó un fragmento de 1,539 pb del gen homólogo a gspD de hardjobovis en el vector pET28a y fue transformado en E. coli cepas C43 y Rosetta. La secuencia de GspDL mostró 46 % de similitud con la secretina GspD de E. coli. La expresión de GspDL recombinante fue lograda en la cepa Rosetta.

Palabras clave: Leptospira, sistema de secreción, E. coli.

 

Leptospira borgpetersenii hardjo (Hardjobovis) produce infertilidad, agalactia y aborto en bovinos así como infección en humanos.1,2 El proteoma de la membrana externa de L. interrogans Lai sugirió 8 proteínas nuevas.3-7 La secuencia parcial de aminoácidos de una (pL18) mostró homología con GspG, una proteína del sistema de secreción tipo II (GSP) en E. coli.3,8

A partir del gen homólogo a gspD de Hardjobovis (3 marcos de lectura arriba de gspG) se amplificaron 1,539 pb. El fragmento, clonado en el vector pET28a, fue transformado en E. coli DE3 cepas: C43 y Rosetta. El plásmido recombinante pAL208 fue secuenciado para confirmación del constructo. E. coli recombinante fue cultivada con kanamicina (50 mg/mL) y glucosa (0,1 a 2 %) a 37 °C durante 1 h en agitación y entonces inducida con IPTG (0,5 a 10 mM) durante 3,5 h a 37 °C o temperatura ambiente. Los cultivos fueron sonicados y sus proteínas separadas en geles desnaturalizantes de poliacrilamida (12 %). Se realizó inmunodetección tipo Western con anticuerpos monoclonales anti-T7 y anti-histidina.

]]> La secuencia de GspDL mostró 46 % de similitud con la secretina GspD de E. coli. Analizando la secuencia nucleotídica, se observó que el uso de codones para arginina en L. borgpetersenii es: AGA–45,45 %; AGG–18,18 % y CGA–18,18 %; mientras que en E. coli es: AGA–3,9 %; AGG–2,2 % y CGA–3,9 %. La inmunodetección de GspDL fue negativa en la cepa C43. Se utilizó entonces la cepa Rosetta codon plus cultivada con 0,2 % de glucosa a 37 °C durante 50 min e inducida con 10 mM de IPTG durante 3,5 h en agitación, para lograr la expresión de GspDL recombinante (66,7 kDa).

A los autores de este trabajo les interesaba entender el papel que desempeñan en Leptospira las proteínas del GSP, en particular su potencial como inmunógenos y maquinaria de secreción. La purificación de GspDL recombinante permitirá producir anticuerpos para ensayos de opsonofagocitosis de L. borgpetersenii y para corroborar la localización de GspDL sobre la superficie de Leptospira.

 

Expression in Escherichia coli of the gspdl gene of the type II secretion system in Leptospira borgpetersenii serovariety hardjo

Summary

A fragment of 1.539 pb of the gene homologous to gspD of Hardjobovis was clonated in the pET28a vector and it was transformed into E. coli C43 and Rosetta strains. The sequence of GspDL showed 46 % of similitude with E. coli GspD secretin. The expression of recombinant GspDL was obtained in Rosetta strain.

Key words: Lepsotspira, secretion system, E. coli.

 Faine S, Adler B, Bolin C, Perolat P. Leptospira and Leptospirosis. 2nd. ed. Melbourne: MediSci; 1999.

  • Cullen PA, Cordwell SJ, Bulach DM, Haake DA, Adler B. Global analysis of outer membrane proteins from Leptospira interrogans serovar Lai. Infect Immun 2002;70:2311-8.
  • Cullen PA, Haake DA, Bulach DM, Zuerner RL, Adler B. LipL21 is a novel surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun 2003;71:2414-21.
  • Guerreiro H, Croda J, Flannery B, Mazel M, Matsunaga J, Galváo Reis, et al. Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans. Infect Immun 2001;69:4958-68.
  • Haake D, Mazel A, McCoy F, Milward G, Chao J, Matsunaga J, et al. Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. International Leptospirosis Society, Second Meeting. Marysville, Victoria, Australia. Australia:Intervet, CLS Veterinary, Pan Bio, Bio Scientific; 1999. p. 22.
  • Haake DA, Chao G, Zuerner RL, Barnett JK, Barnett D, Mazel M, et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun 2000;68:2276-85.
  • Tauschek M, Gorrell RJ, Strugnell RA, Robins-Browne RM. Identification of a protein secretory pathway for the secretion of heat-labile enterotoxin by an enterotoxigenic strain of Escherichia coli. Proc Nat Acad Sci USA 2002;99:7066-71.

    • Recibido: 27 de diciembre de 2004. Aprobado: 10 de marzo de 2005.
    Dr. Alejandro de la Peña-Moctezuma. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.

    * Proyecto financiado por la U.N.A.M. (PAPIIT IN205202) y UC-MEXUS-CONACYT (CN-02-54).

    1 Máster en Ciencias. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.
    2 Doctor en Medicina. Departamento de Microbiología Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia.
    3 Doctor en Medicina. Profesor. Departamento de Microbiología. Universidad de Monash, Clayton, Victoria, Australia. ]]> 4 Doctor en Medicina. Profesor. División de Enfermedades Infecciosas, Universidad de California, Los Ángeles, EE. UU.
    5 Médico Veterinario. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, U.N.A.M., México.

    Índice Anterior Siguiente
    ]]> 1986 118 11-3 1999 2nd 2002 70 2311-8 2003 71 2414-21 2001 69 4958-68 1999 22 2000 68 2276-85 2002 99 7066-71