Lic. Ruby L. González González,1 Lic. Annele Roque Quintero,2 Lic. Luis Morier Díaz3 y Licel de los Ángeles Rodríguez Lay4
Se evaluaron las propiedades antivirales de los extractos vegetales derivados a partir de las plantas: Calendula officinalis L., Psidium guajava L., Eucaliptos spp. y Phyllanthus orbicularis HBK contra el virus de la hepatitis B. Se llevó a cabo a concentraciones subtóxicas en el sistema in vitro PLC/PRF/5 o células Alexander, línea celular que expresa constitutivamente el antígeno de superficie del virus (AgsHB). El parámetro de viabilidad celular se midió mediante el cálculo de los valores de concentración citotóxica media (CC50): Eucalyptus spp. mostró una menor toxicidad en las células, seguido de Psidium guajava L., Phyllanthus orbicularis, y finalmente Calendula officinalis que tuvo una toxicidad mucho mayor que los extractos anteriores. Posteriormente se estudió el comportamiento de la producción de AgsHB intracelular y extracelular de las células a diferentes concentraciones de los extractos durante 48 h de tratamiento. Los datos obtenidos mostraron actividad inhibitoria en el caso de Phyllanthus orbicularis, así como para el extracto de eucalipto. Con el extracto de guayaba la actividad fue menor que en los 2 casos anteriores, mientras que la caléndula no mostró ninguna inhibición a las concentraciones ensayadas, lo que indica la ausencia de la actividad buscada en este extracto.
Palabras clave: Antivirales, virus de la hepatitis B (VHB), PLC/PRF/5, plantas medicinales
El virus de la hepatitis B (VHB) causa serias enfermedades degenerativas del hígado, lo cual provoca una significativa mortalidad y morbilidad mundialmente.1 El desarrollo de terapias antivirales para la hepatitis B crónica ha marcado pautas y una vía alternativa en el tratamiento de los portadores crónicos y la prevención de complicaciones hepáticas como de cirrosis y carcinoma hepatocelular (CHC). La existencia de efectos colaterales adversos de los antivirales sintéticos son factores que le aportan relevancia al estudio de antivirales de origen natural.2
La comisión de Plantas Medicinales del Ministerio de Salud Pública de Cuba ha avalado a las plantas Phyllanthus orbicularis HBK, Eucalyptus spp., Psidium guajava L., y Calendula officinalis L. por sus ricas propiedades medicinales como antiinflamatorias, astringentes, antisépticas, antimicrobianas y dentro de esta última, la actividad antiviral. En otros artículos se demuestra la actividad inhibitoria de estas plantas frente a virus como herpes simple tipo 1 y 2 (VHS);3,4 virus de la inmunodeficiencia humana (VIH);5 y virus infeccioso de la necrosis pancreática.6
Teniendo en cuenta estos antecedentes, en el presente estudio se investigó la actividad antiviral de los extractos derivados del Phyllanthus orbicularis HBK, Eucalyptus spp., Psidium guajava L., Calendula officinalis L., contra el virus de la hepatitis B in vitro.
Extracto vegetal: las tinturas comerciales de Eucalyptus spp., Psidium guajava y Calendula officinalis fueron adquiridas en la red farmacéutica de medicina natural de Ciudad de La Habana; las que se desecaron a una temperatura menor de 45 οC para determinar su concentración. A partir de este punto se prepararon los extractos vegetales a diferentes concentraciones madres (5 y 10 mg/mL).
El extracto liofilizado de la planta Phyllanthus orbicularis HBK procedió de la colecta agosto 1997 (Baró T. Capacidad inactivante del extracto acuoso y de la fracción butanólica de Phyllanthus orbicularis frente al AgsHB. Trabajo para optar por el título de Licenciado en Microbiología. Universidad de La Habana, Facultad de Biología. Ciudad de La Habana, 1999).
]]> Células: los ensayos en cultivo de células se realizaron sobre la línea celular continua de hepatoma humano PLC/PRF/5 (células Alexander, subcultivos 75-81). Estas son células provenientes de un carcinoma primario hepático y expresan la región correspondiente a las proteínas de superficie, sintetizando y secretando constitutivamente el AgsHB que es ensamblado en forma de partículas de 20-25 nm de diámetro. Fueron mantenidas en el Laboratorio de Cultivos Celulares del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí", obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC No. CRL 8024).Esta línea celular que expresa constitutivamente el AgsHB fue crecida en medio de cultivo MEM con aminoácidos no esenciales (MGaane) (Gibco), suplementado con L-glutamina 2 mM y suero fetal bovino inactivo (SFBI) (Gibco) a 10 % y mantenida en condiciones similares, pero con SFBI 2 % bajo valores de temperatura de 37 °C, muy bien controlados.
Ensayo de citotoxicidad (CC50)
La determinación de los efectos citotóxicos de los extractos preparados a partir de las plantas Calendula officinalis L., Psidium guajava L., Eucalyptus spp., y Phyllanthus orbicularis HBK en las células PLC/PRF/5 se llevó a cabo en placas de 96 pozos de fondo plano, empleando el método colorimétrico MTT (3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,-5)- bromido difeniltetrazolio.7 Se sembraron 0,15 mL de suspensión celular de concentración de 2 x 105 células/mL en el medio correspondiente a la línea celular. A las 24 h de sembradas bajo condiciones específicas con la monocapa confluente, se evaluaron por triplicado diferentes concentraciones de cada extracto al añadirse 0,1 mL/pozo de cada dilución y fueron incluidos pozos controles celulares sin extracto vegetal. Finalmente se incubaron bajo las mismas condiciones anteriores.
A las 48 h posteriores a este tratamiento, se procedió a la determinación de la concentración citotóxica media (CC50) por el método colorimétrico MTT, para cada réplica mediante análisis estadístico de regresión lineal, para un coeficiente de determinación mayor que 0,90, empleando el programa Microsoft Excel 2000. Se calculó posteriormente como valor de CC50 final la media de los 3 experimentos con la desviación estándar correspondiente.
Determinación de la concentración efectiva media (CE50)
Los ensayos de evaluación antiviral se realizaron en placas de 96 pozos sembradas a una concentración 2 x 105 células/mL, incubadas 48 h bajo las mismas condiciones descritas. Al cabo de este tiempo, se le adicionaron los extractos de los productos vegetales en ensayo a diferentes concentraciones, y se experimentaron 3 réplicas por cada una.
El sobrenadante de cada pozo se colectó y se realizó la detección del AgsHB extracelular por el método inmunoenzimático UMELISA HBsAg PLUS, que es un método heterogéneo tipo sandwich, desarrollado por el Centro de Inmunoensayo (CIE, La Habana, Cuba) para la detección del AgsHB en suero, plasma o sangre fresca sobre papel de filtro.
El porcentaje de AgsHB presente en los cultivos tratados con respecto a los controles de células, se calculó teniendo en cuenta que los valores de absorbancia obtenidos a partir de estos últimos constituyen 100 %. La concentración de los extractos vegetales capaces de inhibir el AgsHB producido en 50 % fue asumida como la concentración efectiva media (CE50), que se calculó por análisis de regresión lineal.
Determinación del índice selectivo (IS)
]]> El (IS) de cada extracto vegetal se determinó mediante la relación entre la CC50 y la CE50. Se consideró que existía actividad específica cuando IS era superior a 10.8IS = CC50/CE50
Ensayo de citotoxicidad
El análisis gráfico describe una relación casi lineal con pendiente negativa entre el porcentaje de viabilidad celular y las diferentes concentraciones ensayadas de los extractos (fig. 1). En sentido general, el ensayo de citotoxicidad mostró un incremento de la toxicidad celular en la medida en que aumenta la concentración de cada extracto. La viabilidad celular se mantiene con valores superiores a 80 %, a concentraciones similares o inferiores que 500 mg/mL del extracto derivado del P. orbicularis (fig.1-I). A concentraciones superiores a este valor comienzan a observarse efectos tóxicos en las células, lo cual se manifiesta de forma proporcional al incremento de las concentraciones empleadas.
A diferencia del comportamiento de la viabilidad celular que es observable con el extracto derivado de la planta Calendula officinalis L. (fig.1-II), la viabilidad celular se mantiene con valores superiores a 80 %, a concentraciones tan bajas como 125 mg/mL; observándose posteriormente una considerable disminución de la población de células, que decrece hasta menos de 20 %, con concentraciones superiores a los 250 mg/mL del extracto, con respecto al P. orbicularis. Los resultados de este parámetro frente a diferentes concentraciones del extracto vegetal de la caléndula muestran una toxicidad notablemente superior.
El extracto vegetal preparado a partir de la planta Psidium guajava L. (fig. 1-III) muestra una toxicidad mucho menor sobre la línea celular PLC/PRF/5 con respecto al de la caléndula: concentraciones menores que 1 000 mg/mL presentan una viabilidad celular por encima de 80 %, parámetro que alcanza 50 % entre 2 000-2 500 mg/mL y continúa disminuyendo hasta 21,13 % con 5 000 mg/mL del extracto.
Las células tratadas con el extracto de Eucalipto mantuvieron niveles de viabilidad superiores a 80 % hasta concentraciones inferiores a 2 000 µg/mL, permaneciendo más de 50 % de las células viables con concentraciones de hasta 4 000 µg/mL (fig. 1-IV).
Fig. 1. Porcentajes de viabilidad celular según el método de MTT en células PLC/PRF/5, tratadas con diferentes concentraciones de los extractos Phyllanthus orbicularis HBK (I), Calendula officinalis L (II), Psidium guajava L (III) y Eucalyptus ssp. (IV), a las 48 h de incubación. Se representa el resultado de una de las 3 réplicas realizadas para cada extracto.
Con los resultados obtenidos para las 3 réplicas de cada extracto, se calcularon los valores de CC50, a partir de las ecuaciones de regresión correspondientes a las líneas de tendencia con valores de coeficientes de regresión superiores a 0,90 (tabla 1).
]]> Tabla 1. Valores de concentración citotóxica media (CC50) de los extractos evaluados| Extracto | CC50 ± S (mg/mL) |
| Calendula officinalis L. | 165,51 ± 2,08 μg/mL |
| Psidium guajava L. | 2414,84 ± 107,85 mg/mL |
| Eucalyptus ssp, | 4007,565 ± 44,6 mg/mL |
| ]]> Phyllanthus orbicularis HBK | 2267,64 ± 113,09 mg/mL |
Ensayo antiviral
El ensayo antiviral prosiguió a los de citotoxicidad, por lo que se inició sobre la base del conocimiento de las concentraciones subtóxicas (con una viabilidad superior a 90 %) de cada extracto (fig. 2).
Fig. 2. Efecto de los extractos de P. orbicularis (A), Eucalyptus spp. (B), Psidium guajava (C) y Calendula officinalis (D) sobre la producción del AgsHB extracelular en las células PLC/PRF/5 a las 48 h de tratamiento. En cada caso se representa el resultado de una de las 3 réplicas realizadas.
Las células tratadas con el extracto de Eucalyptus spp. muestran una inhibición del antígeno producido con concentraciones cercanas a 125 mg/mL y superiores, lográndose más de 90 % de inhibición del AgsHB a partir de los 250 mg/mL (fig. 2-B). Este comportamiento es ligeramente superior al observado con el extracto de Phyllanthus (fig. 2-A), donde se evidencia una inhibición con valores de 200 mg/mL o superiores, que alcanza 90 % a partir de 400 mg/mL.
El extracto de guayaba (fig. 2-C) produce una inhibición del AgsHB a mayores concentraciones; detectándose más de 80 % de antígeno a concentraciones cercanas a 187,5 mg/mL, con respecto a lo observado anteriormente; a partir de la cual se comienza a observar una disminución de este marcador que llega a ser 80 % con 500 mg/mL del extracto. El extracto de caléndula (fig. 2-D), a diferencia de lo evidenciado con los otros, no mostró ninguna inhibición in vitro del AgsHB a las concentraciones ensayadas.
Se determinó la línea de tendencia con valores de coeficiente superiores a 0,90 para cada extracto. El cálculo de las ecuaciones de regresión lineal permitió hallar los valores de CE50 que se muestran en la tabla 2 y corroboran el comportamiento gráfico. Dado los resultados encontrados con Caléndula, no fue factible calcular la CE50 para esta planta (tabla 2).
]]> Tabla 2. Valores de concentración efectiva media (CE50) de los extractos vegetales evaluados| Extracto | CE50 ± S (mg/mL) |
| Phyllanthus orbicularis | 185,14 ± 9,73 |
| Eucalyptus ssp, | 158,99 ± 14,9 |
| Psidium guajava L | 360,34 ± 13,8 |
El cálculo de la relación entre la CC50 y la CE50, índice selectivo (IS), ofreció un criterio más completo del efecto anti-VHB (AgsHB) de estas plantas (tabla 3).
Tabla 3. Valores del índice selectivo (IS) de los extractos vegetales evaluados.
| Extracto | IS (CC50/CE50) |
| Phyllanthus orbicularis | 12,25 |
| Eucalyptus ssp. | 25,21 |
| ]]> Psidium guajava L | 6,70 |
Se estudiaron las propiedades antivirales de los extractos Phyllanthus orbicularis HBK, Eucalyptus spp., Psidium guajava L. y Calendula officinalis L., frente al VHB por su capacidad de inhibición de uno de los marcadores de infección viral (AgsHB), en las células Alexander.
El P. orbicularis HBK es una planta endémica cubana la cual ha mostrado actividad antiviral in vitro frente a los virus herpes simple tipo 1 y 2 y al herpesvirus bovino tipo 1,4,9 además su actividad antiviral contra el VHB en la línea celular PLC/PRF/5 ha sido comprobada por otros autores (Salazar I. Actividad del extracto acuoso y la fracción acético acuosa Phyllanthus orbicularis HBK sobre la viabilidad celular y la producción de AgsHB en células PLC/PRF/5. Trabajo para optar por el título de Licenciado en Microbiología. Universidad de La Habana, Facultad de Biología. Ciudad de La Habana, 2001). Sobre la base de estos datos el P. orbicularis se tomó como control para el análisis comparativo del porcentaje de supervivencia celular y la actividad antiviral medida por la cantidad de AgsHB producido por las células, con los restantes extractos vegetales derivados Eucalyptus spp., Psidium guajava L. y Calendula officinalis L., respectivamente.
Los resultados alcanzados con las plantas en el ensayo de citotoxicidad evidenciaron una disminución en la viabilidad celular en la medida en que aumentaba la concentración de cada extracto vegetal. El extracto de Eucalyptus spp. mostró una menor toxicidad en las células seguido de Psidium guajava L., P. orbicularis y finalmente, Calendula officinalis, que tuvo una toxicidad mucho mayor que los extractos anteriores, efecto que pudiera atribuírsele a la presencia de flavonoles en este.10
El extracto de Eucalyptus spp. mostró la mayor actividad inhibitoria con un IS de 25,21, el doble, inclusive, que el obtenido para el extracto de P. orbicularis que constituía la referencia o el control positivo del efecto antiviral buscado. Estudios fitoquímicos realizados en especies de Eucalyptus, muestran la presencia en la planta de compuestos fenólicos como los taninos y flavonoides, que son responsables de la actividad inhibitoria del AgsHB in vitro mostrada por el extracto de P. orbicularis en otros ensayos antivirales (Del Barrio G. Actividad antiviral in vitro de Phyllanthus orbicularis. Tesis de Doctorado. Universidad de La Habana, Facultad de Biología. Ciudad de La Habana, 1999) (Romeu B. Evaluación antiviral, contra el virus del herpes simple tipo 1, de fracciones químicas de Phyllanthus orbicularis HBK. Tesis de Diploma. Universidad de La Habana, Facultad de Biología. Ciudad de La Habana, 2000) (Roque A. Actividad in vitro del extracto acuoso de Phyllanthus orbicularis HBK frente al VHB. Tesis para optar por el Título Académico de Maestro en Microbiología. Mención Virología. Universidad de La Habana, Facultad de Biología. Ciudad de La Habana, 2003).
La actividad antiviral del extracto derivado de Psidium guajava es baja (IS= 6,7), si se tiene en cuenta el criterio de Wyde,8 quien plantea que un extracto natural debe poseer un IS>10 como indicativo de actividad antiviral in vitro, aunque existen otros autores que aceptan un IS>2.11 En los datos obtenidos se observa que existe cierta inhibición del antígeno, por lo que los autores de este trabajo creen que se pudieran continuar los estudios con esta planta, más aún si se tiene en cuenta que se ha reportado la presencia en la misma de compuestos como los triterpenos, referidos con actividad antiviral en la literatura especializada, y que se ha observado actividad de esta planta frente a otros virus.6
Existen estudios que plantean actividad antiviral in vitro de Caléndula officinalis frente al VIH, rhinovirus, herpes simple e influenza;5 aunque no se encontró ningún reporte de evaluación de la actividad antiviral de frente al VHB.
Estos resultados apoyan los alcanzados previamente para la especie Phyllanthus orbicularis, a la vez que indican la presencia de marcada actividad antihepatitis en extractos de Eucalyptus spp.
]]> Este trabajo constituye el primer reporte acerca de este tipo de estudio en los extractos obtenidos a partir de plantas cubanas de Eucalyptus spp., Psidium guajava L. y Calendula officinalis según las búsquedas y revisiones realizadas. Los resultados alcanzados contribuyen al conocimiento de las propiedades de las plantas medicinales cubanas y abren un camino para futuros estudios de actividad antiviral de estas y el empleo de alguna como candidato para el tratamiento de la hepatitis B.The antiviral properties of plants extracts derived from Calendula officinalis L., Psidium guajava L., Eucaliptus spp. y Phyllanthus orbicularis HBK against the hepatitis B virus were evaluated at subtoxic concentrations in the in vitro PLC/PRF/5 system or Alexander cells, a cell line expressing constitutively the virus surface antigen (AgsHB). The cell viability parameter that was measured by the calculation of the mean cytotoxic concentration values (CC50): Eucalyptus spp. showed a lower toxicity in the cells, followed by Psidium guajava L., Phyllanthus orbicularis, and finally Calendula officinalis that had a much higher toxicity than the previous extracts. Later on, it was studied the behaviour of the production of intracellular and extracellular HBsAg of the cells at different concentrations of the extracts during 48 hours of treatment. The data obtained showed an inhibitory activity in the case of Phyllanthus orbicularis, as well as for the eucaliptus extract. With the guava extract, the activity was lower than in the 2 previous cases, whereas calendula did not show any inhibition to the assayed concentrations, which proves the absence of the activity searched in this extract.
Key words: Antivirals, hepatitis B virus (HBV), PLC/PRF/5, medicinal plants.
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2. Hanazaki, K. Antiviral therapy for chronic hepatitis B: a review. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2004;3:63-70.
3. Schnitzler P, Schon K, Reichling J. Antiviral activity of Australian tea tree oil and eucalyptus oil against herpes simplex virus in cell culture. Pharmazie 2001; 56:343-7.
4. Del Barrio G, Parra F. Evaluation of the antiviral activity of an aqueous extract from Phyllanthus orbicularis. J Ethnopharmacol 2000;72:317-22.
5. Kalvatchev Z, Walder R, Garzaro D. Anti-HIV activity of extracts from Calendula officinalis flowers. Biomed Pharmacotherapy 1997;51:176-80.
6. Veira F, Rodríguez D, Gonolves F, Menezes F, Aragï J, Sousa O. Microbicidal efect of medicinal plant extracts (Psidium guajava Linn. and Carica papaya Linn.) Upon bacteria isolated from muscle and know to induce diarrhea in children. Rev Inst Med Trop S. Paulo 2001;36-4665.
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11. Vander A, Haemers A, Vlietinck J. Antiviral agents from higher plants and example of structure-activity relationship of 3-methoxyflavones. En: Colegate M y Molyneux J eds. Bioactive natural products. Detection, isolation and structural determination. Boca Ratón:CRC Press;1993. p.405-40.
Recibido: 10 de marzo de 2006. Aprobado: 29 de mayo de 2006.
Lic. Ruby L. González González. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Autopista Novia del Mediodía, Km 6 ½, AP 601, municipio La Lisa, Ciudad de La Habana. Teléf.: 2020426, Telefax 2046051 Correo electrónico: ruby@ipk.sld.cu
1 Licenciada en Bioquímica. Reserva Científica.
2 Máster en Virología. Licenciada en Microbiología. Profesora Auxiliar.
3 Máster en Virología. Licenciado en Microbiología. Investigador Titular ]]>
4 Doctora en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Microbiología.