Caracterización de un extracto de Ipomoea batatas para ser utilizado en calidad de base nutritiva en medios de cultivo

Characterization of Ipomoea batatas extract to be used as nutrient basis for culture media

Ing. Tamara Lobaina Rodríguez^I; Dr. Claudio Rodríguez Martínez^II; Dra. Raisa Zhurbenko^III

^I Máster en Ciencias en Biología Vegetal, Ingeniera Química. Investigadora Agregada. Centro Nacional de Biopreparados (BioCen).
^II Doctor en Ciencias Técnicas, Ingeniero Tecnólogo. Investigador Titular. BioCen
^III Doctora en Ciencias de los Alimentos. Ingeniera Tecnóloga. Investigadora Titular. BioCen.

Se caracterizó para su empleo en calidad de base nutritiva un extracto de Ipomoea batatas, obtenido por hidrólisis enzimática con alfa amilasa. Se destacó entre sus indicadores de calidad, el contenido de carbohidratos totales con valores superiores a 50 % respecto a su masa nominal, determinado por el método fenol-sulfúrico. Se detectó igual contenido de nitrógeno amínico, cuantificado por el método de valoración potenciométrica en presencia de formaldehído, y del nitrógeno total (0,23 %), valorado por el método de Kjeldahl. El contenido de elementos minerales necesarios para el cultivo microbiano se determinó por el método de absorción atómica. El estudio de la reactividad biológica del extracto vegetal mostró la presencia de aminoácidos esenciales para los microorganismos, como son triptófano, cistina y cisteína. Se demostró la capacidad del extracto vegetal, empleado como única fuente de nutrientes a diferentes concentraciones (2, 4 y 10 %), de promover el crecimiento de bacterias y levaduras. El incremento de biomasa, determinado en un medio especialmente diseñado (SIGMA, EE. UU.), alcanzado para 2 cepas de Candida albicans fue significativamente superior al logrado con otras bases nutritivas, como peptona de soya, extracto de levadura, triptona y peptona micológica. Se evidenció que el extracto vegetal como componente de un medio de cultivo no contiene compuestos con efecto antibacteriano, porque a concentraciones desde 15 hasta 30 g/L, logró promover el crecimiento microbiano hasta valores (UFC/mL) similares a los obtenidos con el medio de referencia agar triptona soya.

Palabras clave: Ipomoea batatas, extracto vegetal, bases nutritivas, cultivo de microorganismos.

An Ipomoea batatas extract obtained by enzymatic hydrolysis with alpha amylase was characterized to be used as nutrient basis. Among its quality indicators, it had a content of over 50 % whole carbohydrates with respect to the nominal mass, estimated by phenol-sulphur method. The same content of aminonitrogen detected and quantified by potentiometric titration using formaldehyde and of total nitrogen (0.23 %) by Kjeldahl method were detected. The content of necessary mineral elements for microbial culture was determined by the atom absorption method. The study of biological reactivity of the vegetal extract showed the existence of essential aminoacids such as triptophane, cystine and cysteine for microorganisms. It was proved that the vegetal extract, when used as the only source of nutrients at various concentration levels (2, 4 and 10%), is capable of stimulating the growth of bacteriae and yeasts. The increase of two Candida albicans biomass, determined in a specially designed medium (SIGMA, USA), was significantly higher to that of other nutrient bases like soy peptone, yeast extract, triptone and micological peptone. It was evinced that the vegetal extract as a culture medium component did not have antimicrobial effect compounds since at 15-30 g/L concentrations, this extract did stimulate the microbial growth up to values (UFC/mL) similar to those of the reference media called agar triptone soy. ]]>

Key words: Ipomoea batatas, vegetal extract, nutrient bases, microorganism culturing.

INTRODUCCIÓN

Para el cultivo de microorganismos también se han utilizado diferentes bases nutritivas de origen vegetal, como son el extracto de malta, papa, maíz, reportadas por Bridson y de arroz, col, zanahoria, entre otras.^4,5

Las raíces y los tubérculos tropicales son fuentes importantes de alimentos ricos en energía. Ipomoea batatas es uno de los cultivos más importantes y versátiles del mundo, produce más alimento que cualquier otra raíz con aportes importantes de provitamina A y ácido ascórbico.⁶ El contenido de proteínas, grasa y fibra es bajo, pero la elevada fracción de nitrógeno libre es un indicativo de su valor potencial, principalmente como una fuente de energía. Los carbohidratos presentes se encuentran en cantidades de 80 a 90 % con respecto a su peso seco y, por otro lado, el almidón contenido sin tratamiento de cocción es muy resistente a la hidrólisis por la alfa amilasa.^6,7

De Ipomoea batatas se han evaluado propiedades bioactivas y funcionales, como su actividad antioxidante, conveniente en el cultivo de tejidos y células superiores, el contenido de antocianinas y fenoles y su efecto antimicrobiano.^8-10

El empleo de métodos hidrolíticos de proteínas o de fuentes de carbono, propician la obtención de un producto con un adecuado contenido de sustancias nitrogenadas de origen proteico y de sustancias aportadoras de energía, que garantizan la calidad de las bases nutritivas para el cultivo de microorganismos,¹¹ pero hasta la fecha no se ha abordado la obtención de un extracto de Ipomoea batatas con estos fines.

El presente trabajo tuvo como objetivo caracterizar un extracto nutritivo de Ipomoea batatas obtenido por un método hidrolítico.¹² Se determinaron sus principales indicadores físico-químicos, organolépticos y microbiológicos, con el fin de emplear el extracto como base nutritiva para el cultivo de diferentes especies microbianas.

MÉTODOS

Caracterización del extracto vegetal

Se realizó la caracterización organoléptica y físico-química según lo descrito por Zhurbenko para las bases nutritivas,¹¹ pérdida por desecación, carbohidratos totales, detección cualitativa de almidón,¹³ triptófano libre, cloruros (como NaCl) en presencia de proteínas por el método de Volhard,¹⁴ contenido de nitrógeno amínico¹⁵ y el contenido de nitrógeno total, según el método de Kjeldahl.¹⁶ Para la determinación del pH se prepararon soluciones de la base nutritiva al 2 % (p/p), se esterilizaron en autoclave a 121 °C durante 15 min; posteriormente se dejaron refrescar hasta la temperatura de 25 °C y se procedió a medir el pH en un pH-metro (PHM 83 AUTOCAL-Dinamarca).

Se determinó la capacidad amortiguadora del extracto vegetal expresada como los milimoles de ácido clorhídrico 1 N o hidróxido de sodio 1 N necesarios para causar un cambio en una unidad del pH.¹⁷ El rendimiento del producto se determinó, expresando el porcentaje de la relación del contenido de sólidos totales presentes en el polvo con respecto a la masa seca de sustrato proteico sometido al proceso hidrolítico. La determinación de potasio, sodio, calcio, magnesio, zinc, manganeso, cobre, cobalto plomo y cadmio se realizó en un espectrofotómetro de absorción atómica SP9 de la Pye Unicam System^18,19 y el contenido de fósforo, por el método colorimétrico vanadato-molibdato en un espectrofotómetro UV-vis de la Pye Unicam System.²⁰

Material biológico

Para el estudio de promoción del crecimiento microbiano en diferentes formulaciones de medios, se utilizaron cepas certificadas de bacterias y levaduras provenientes de la American Type Culture Collection (ATCC), entre ellas: Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcencens ATCC 14756, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Proteus vulgaris ATCC 13315, Citrobacter freundii ATCC 8090, Shigella flexneri ATCC 12022, Candida albicans ATCC 10231, Candida albicans ATCC 17111 y Saccharomyces cerevisiae ATCC 9080. El pH de los medios especialmente formulados se ajustó a 7,0 para las bacterias y a 6,5 para las levaduras. Los cultivos se incubaron a la temperatura optima para las bacterias (35 ± 2 °C) y para las levaduras (30 ± 2 °C), y se interpretaron los resultados a las 24 h.

Evaluación microbiológica del extracto vegetal

La detección de sulfuro de hidrógeno, producción de indol, presencia de carbohidratos fermentables y producción de acetilmetilcarbinol (prueba de Voges-Proskauer) se realizaron por los métodos recomendados por la USP XXIV.¹³

Para evaluar la capacidad de promoción del crecimiento microbiano se formularon medios de cultivo simples que contenían el extracto vegetal a concentraciones de 2, 4 y 10 %, combinados con cloruro de sodio 0,5 % (p.a., Applichem, Alemania) y fosfato de sodio 0,1 % (p.a., Applichem) (SIGMA. Biochemicals and Reagents for Life Science Research. 2000:153).

El incremento de la biomasa microbiana de 2 cepas de Candida albicans (ATCC 10231 y 17111) en el tiempo, proporcionada por el extracto de Ipomoea batatas, se comparó con el logrado con otras bases nutritivas comerciales, como son triptona (BioCen, Cuba), peptona de soya (Biotécnica Internacional, México), extracto de levadura (BioCen) y peptona micológica (BioCen). El medio de cultivo especialmente diseñado se formuló con 2 % de la base nutritiva, según recomienda SIGMA SIGMA. Biochemicals and Reagents for Life Science Research. 2000:153).

Las curvas de crecimiento se elaboraron a partir de los valores de absorbancia medidos cada 1 h en un espectrofotómetro HACH, Modelo DR 4000, EE. UU., a 640 nm; los cultivos de bacterias y levaduras se mantuvieron a la temperatura óptima de cultivo. La dinámica del crecimiento para levaduras y bacterias se evidenció mediante curvas de crecimiento en el tiempo y se expresó gráficamente el incremento de la absorbancia como (ABS t_{h -} ABS t₀)/ ABS t₀, donde ABS t_h: valores de absorbancia medidos en cada hora de cultivo y ABS t₀: absorbancia en el tiempo cero.

Actividad inhibitoria

RESULTADOS

El producto obtenido con ayuda del método hidrolítico resultó un polvo fino, muy higroscópico, homogéneo, fluido, sin grumos y sin partículas extrañas, fácilmente soluble en agua y su solución al 2 % (p/p) presentó un color amarillo, transparente y brillante.

La media de los indicadores de calidad físico-químicos que caracterizan los 3 lotes industriales del extracto vegetal se presentan en la tabla 1.

La pérdida por desecación resultó 3,03 ± 0,24 %. El método definido a escala industrial, posibilitó obtener el extracto con un contenido de carbohidratos totales de 58,06 ± 2,76 % y no se detectó almidón. Se distinguió, entre otros indicadores de calidad, la presencia de triptófano libre en 0,14 %. El contenido de cloruros se mantuvo en 1,53 ± 0,08 % y el de nitrógeno amínico coincidió con el del nitrógeno total (0,23 ± 0,01 %), para 100 % de su relación.

Se logró obtener un extracto con una capacidad amortiguadora idéntica frente al ácido clorhídrico y al hidróxido de sodio e igual a 0,37 ± 0,01. El rendimiento industrial (50,34 ± 7,96 %) resultó elevado si se tiene en cuenta que se trata de una base nutritiva obtenida por extracción de una raíz que contiene alrededor de 60 % de agua.

El contenido de potasio, sodio y fósforo (libre y en forma de fosfato) se encontró en un porcentaje entre 0,37 y 1,93 sobre la base de 100 g de extracto vegetal. Las concentraciones de calcio y magnesio correspondieron a 301 y 227 mg/g, respectivamente. El zinc se cuantificó en 3,33 mg/g y el resto de los elementos se mantuvo por debajo de 0,1 mg/g del producto.

Los indicadores de la reactividad biológica del extracto nutritivo (tabla 3) resultaron adecuados, se corroboró la presencia de carbohidratos fermentables y de aminoácidos como: triptófano, cistina y cisteína.

La existencia de triptófano se evidenció por la producción de indol con Escherichia coli como control positivo de la prueba y Enterobacter aerogenes como control negativo. La presencia de aminoácidos sulfurados (cistina y cisteína) se detectó con Salmonella typhimurium, por la prueba de producción de sulfuro de hidrógeno.

La determinación cualitativa de carbohidratos fermentables, coincidió con los resultados encontrados en la tabla 1 (contenido de carbohidratos totales), y resultó positiva para Escherichia coli, microorganismo utilizado como control.

Se manifestó un elevado grado de hidrólisis de las proteínas presentes en la raíz reservante, según la prueba de acetilmetilcarbinol, la cual resultó positiva para el control de Enterobacter aerogenes.

El ensayo de promoción del crecimiento microbiano demostró que el extracto nutritivo de Ipomoea batatas, empleado como única fuente de nutrientes, a concentraciones de 2, 4 y 10 % en un medio de cultivo simple, fue capaz de promover el crecimiento de bacterias y levaduras (fig. 1).

Escherichia coli (fig. 1a) y Enterobacter aerogenes (fig. 1b) manifestaron un incremento de biomasa inversamente proporcional a la concentración del extracto nutritivo, alcanzando los mayores valores a la concentración más baja (2 %). La masa microbiana logró multiplicarse a partir de su valor inicial para Escherichia coli hasta 18 veces y para Enterobacter aerogenes cerca de 35 veces, utilizando el extracto vegetal a una concentración de 2 % en el medio simple.

Sin embargo, para Saccharomyces cerevisiae y Candida albicans (figs. 1c y 1d, respectivamente) se encontró una relación directa en cuanto al incremento de la biomasa y las concentraciones del extracto vegetal ensayadas. Se registró un incremento de biomasa para Saccharomyces cerevisiae de 5,5 veces respecto al valor inicial y para Candida albicans de 3,5 veces utilizando el extracto vegetal al 10 % de concentración en el medio simple.

Al comparar la funcionalidad biológica del extracto vegetal con la de otras bases nutritivas comerciales de distintos orígenes proteicos, como caseína, soya, músculo animal y levadura, el nuevo extracto proporcionó un incremento de biomasa significativamente superior para las cepas de colección Candida albicans ATCC 17111 (fig. 2a) y Candida albicans ATCC 10231 (fig. 2b). Se alcanzaron valores de biomasa, para ambas especies, que duplicaron la concentración inicial de inóculo microbiano durante un período de 24 h de cultivo.

DISCUSIÓN

La elevada solubilidad y transparencia de la solución acuosa del extracto nutritivo son características organolépticas favorables para una base nutritiva, la primera garantiza la disponibilidad de todos sus nutrientes disueltos en el medio de cultivo para ser asimilados por los microorganismos, y la segunda es muy conveniente porque, en los caldos formulados, la aparición de turbiedad es un indicador del crecimiento microbiano.

Según Zhurbenko,¹¹ el valor de pérdida por desecación inferior a 7 % resulta un requisito de calidad fundamental para este tipo de producto altamente higroscópico. Los bajos valores de humedad permiten una mayor estabilidad del producto durante su conservación, al evitar la interacción química y la degradación de sus componentes.

El contenido elevado de carbohidratos totales reflejó que el método de hidrólisis con exo-enzimas reportado por Rodríguez y otros, lograron extraer los azúcares libres contenidos en la raíz y recuperar de manera eficiente los azúcares derivados de la hidrólisis completa del almidón.¹² La conversión total del almidón en otros componentes carbonados más simples se evidenció al no detectar cualitativamente su presencia.

El triptófano en el extracto vegetal le confiere características adecuadas para el cultivo de microorganismos, porque este aminoácido resulta esencial para la realización de las funciones metabólicas microbianas.

Los valores obtenidos de cloruro de sodio para los lotes producidos corresponden con los reportados por Bridson⁴ y Zhurbenko,¹¹ y se encuentran por debajo de 9 %. A estas concentraciones el cloruro de sodio no ejerce efecto inhibitorio sobre el crecimiento microbiano y resulta beneficioso como regulador del equilibrio osmótico en el medio de cultivo.

Resultó interesante establecer que el extracto vegetal posee la misma capacidad de amortiguación del pH, tanto para los ácidos como para las bases, porque las bases nutritivas conocidas generalmente presentan diferentes valores de este indicador ante ambos tipos de sustancias químicas.¹⁷ Esta propiedad es conveniente al formular medios de cultivo que contengan entre sus ingredientes sustancias que, al ser utilizadas por los microorganismos, generan metabolitos que alteran el pH del medio, y ese cambio puede ser amortizado por el propio extracto vegetal.

Los indicadores de calidad organolépticos y físico-químicos encontrados en el extracto de Ipomoea batatas corresponden satisfactoriamente con otros extractos de similar naturaleza proteica, diseñados para el cultivo de microorganismos.⁴

Los macroelementos y microelementos minerales encontrados en el extracto vegetal son fundamentales para el crecimiento de diversas especies microbianas. Se destacan las elevadas concentraciones de potasio, fósforo, en forma de fosfato, y calcio, mayores que las reportadas para otros extractos de origen vegetal, por ejemplo, extracto de malta.¹⁷

La presencia de tales iones minerales en el extracto, según Bridson,¹⁷ garantiza el crecimiento satisfactorio de los microorganismos dado a las funciones biológicas que estos minerales desempeñan dentro del medio de cultivo.

El contenido de estos elementos en el extracto vegetal permite formular medios de cultivo sin necesidad de suplementarlos con otros compuestos químicos.

Los hallazgos obtenidos en relación con la presencia de aminoácidos esenciales para el cultivo de microorganismos (triptófano, cistina y cisteína) en el extracto vegetal, indican una muy favorable calidad nutricional de esta base nutritiva.

La presencia de triptófano libre, revelado por la actividad triptofanasa de Escherichia coli y la correspondiente producción de indol, coincide con los datos cuantitativos reflejados en la tabla 1. Por otra parte, mediante del metabolismo de Salmonella thyphimurium con respecto a los aminoácidos sulfurados presentes en el extracto vegetal, se logró detectar la presencia de cistina y cisteína, considerados indispensables para el crecimiento microbiano, por la incapacidad que poseen los microorganismos de sintetizarlos, y para soportar las funciones que desempeñan en el crecimiento microbiano.

La detección de carbohidratos fermentables en el extracto vegetal resulta muy conveniente, pues estos actúan como fuentes nutritivas carbonadas que aportan energía al cultivo microbiano, característica muy generalizada en otros extractos de similar naturaleza.¹⁷ Cualitativamente se demostró el contenido de carbohidratos por el cambio de color del indicador de pH, dado por la producción de ácido y gas, a partir de la fermentación de los compuestos carbonados presentes. Estos compuestos carbonados surgen como resultado de la degradación del almidón presente en el sustrato vegetal, acorde a lo señalado por Navas y otros,⁶ por la acción de la alfa amilasa y del tratamiento térmico. De acuerdo con Hagenimana y otros,⁷ los carbohidratos presentes (glucosa, fructuosa, maltosa, sacarosa, maltotriosa y dextrinas), son portadores de energía en los cultivos microbianos y le confieren propiedades originales al extracto para ser empleado en medios de cultivo de propósito general.

Las formulaciones evaluadas con varias concentraciones del extracto vegetal, como única fuente de nutrientes al 2, 4 y 10 %, poseen diferentes composiciones nutricionales.

Los niveles de concentración de las sustancias nutritivas carbonadas, nitrogenadas y minerales que el extracto posee, influyen en el desarrollo y crecimiento bacteriano. Las elevadas concentraciones del extracto vegetal 10 y 4 %, lejos de favorecer la nutrición microbiana, afectó el crecimiento de las bacterias. Este hecho puede estar relacionado con la composición propia del extracto vegetal que posee un porcentaje de nitrógeno amínico relativamente bajo respecto a otras bases nutritivas de diferente naturaleza proteica. Las sustancias nitrogenadas son menos preferidas frente a la alta disponibilidad de carbohidratos y, al parecer, estos últimos son primeramente asimilados por las bacterias. La multiplicación de las bacterias se retarda de manera considerable, pues la disponibilidad de principios nutritivos no continúan siendo favorables durante mucho tiempo, porque los productos de desecho propios del metabolismo se acumulan y tienden a disminuir el ritmo de multiplicación. Ocurren grandes cambios que pueden producirse en poco tiempo, como son la acidificación del medio de cultivo, elemento significativo para el cultivo de bacterias, y resulta óptimo el punto de neutralidad o cerca de este (pH de 6,8 a 7,5).²³

Por otro lado, los incrementos de biomasa alcanzados por las levaduras son menores al compararlos con los logrados para las bacterias. Esto es porque las levaduras realizan una variedad extraordinariamente amplia de complejas reacciones químicas asociadas con el crecimiento, reproducción y mantenimiento. Su forma de reproducción es más compleja que la de las bacterias y por ello su crecimiento es más lento.²² Sin embargo, la presencia de sustancias carbonadas favorecen sus requerimientos nutricionales. La presencia de enzimas, como son las carbohidrasas en las levaduras, así como la variedad de elementos minerales presentes en el extracto vegetal que actúan como cofactores enzimáticos, permiten la acción sobre los carbohidratos disponibles en el medio. A pesar de que la degradación de los carbohidratos origina, a su vez, considerables cantidades de ácido y gas, este hecho no afecta el desarrollo de las levaduras, las cuales se desarrollan de manera favorable a pH ácido.^4,23

El incremento significativamente superior de la biomasa microbiana alcanzada por el extracto de Ipomoea batatas, respecto a otras bases nutritivas comerciales, se debe a que, para el cultivo de levaduras se eligen, con particular interés, bases nutritivas ricas en sustancias carbonadas.²³

Varios autores coinciden que los extractos de origen vegetal, como el extracto de malta, extracto de arroz, extracto de harina de maíz, extracto de papa, entre otros, empleados para formular medios de cultivo diseñados para el cultivo, aislamiento y mantenimiento de levaduras y mohos, poseen entre sus indicadores de calidad, la presencia de sustancias nutritivas carbonadas con porcentajes superiores a 50 % respecto a la masa seca del producto, capaces de proporcionar condiciones de crecimiento precoz y exuberante.^4,23

Resulta interesante la no existencia de diferencias significativas entre los recuentos de las especies de bacterias evaluadas, a concentraciones de hasta 30 g/L del extracto vegetal en las formulaciones ensayadas, con respecto al medio de referencia agar triptona soya, a pesar de que algunas de ellas poseen requerimientos nutricionales especiales.

En varios trabajos anteriores se ha reportado el uso de extractos de origen vegetal con el fin de inhibir bacterias y hongos, basado en sus compuestos antioxidantes (ácido ascórbico, carotenoides, polifenoles o taninos y flavonoides), repartidos en diversos órganos, en especial raíces, como es el caso del sustrato empleado.^24,25 Sin embargo, este resultado pone de manifiesto que el proceso de obtención del extracto vegetal elimina los inhibidores microbianos presentes en la raíz de Ipomoea batatas reportados por In-Chang y otros⁹ y Decker y Jaenicke,¹⁰ que evidenciaron la presencia de las peroxidasas en la batata.

El extracto de Ipomoea batatas, obtenido a través del proceso hidrolítico, posee indicadores de calidad que lo convierten en una excelente base nutritiva capaz de garantizar el crecimiento de bacterias y levaduras.

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Ing. Tamara Lobaina Rodríguez. Centro Nacional de Biopreparados (BioCen), Apartado 6048, Habana 6, CP 32600, Cuba. Teléf.: (047) 68-2441, Fax: (53 7) 33 8439.Correo electrónico: lobaina@biocen.cu