Evaluación del nuevo medio CromoCen ECCS para la detección e identificación
de bacterias enteropatógenas
Evaluation of the new CromoCen ECCS medium for detection and identification of enteropathogenic bacteria ]]>
Anna TsoraevaI; Jorge Luis Muñoz del CampoII; Raisa ZhurbenkoIII; Claudio Rodríguez MartínezIV; Meylín Ortega GonzálezV
I Máster en Ciencias en Microbiología General. Investigadora Auxiliar. Ciudad de La Habana, Cuba.
II Licenciado en Microbiología. Ciudad de La Habana, Cuba.
III Doctora en Ciencias de los Alimentos. Investigadora Titular. Ciudad de La Habana, Cuba.
IV Doctor en Ciencias Técnicas. Investigador Titular. Ciudad de La Habana, Cuba.
V Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Aspirante a Investigadora. Ciudad de La Habana, Cuba.
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RESUMEN
Introducción: últimamente se ha desarrollado una variedad de medios de cultivo cromogénicos que constituyen herramientas útiles para el diagnóstico microbiológico.
Objetivo: evaluar la eficacia de un nuevo medio cromogénico/fluorogénico, CromoCen ECCS, para la detección e identificación presuntiva de bacterias gramnegativas en el análisis de muestras fecales.
Métodos: en el estudio de inclusividad se utilizaron 10 cultivos bacterianos de colecciones de referencia y 33 de origen clínico. Para el análisis de funcionalidad se emplearon 68 muestras fecales de un hospital pediátrico. Como referencia se emplearon los medios de cultivo agar SS y agar MacConkey. La identificación se realizó mediante pruebas bioquímicas y serológicas.
Resultados: se evidenció que 92,8 % de las cepas de Salmonella enterica, incluidos los serotipos Typhi y Paratyphi, desarrollaron colonias con características típicas en el medio de cultivo cromogénico. La sensibilidad, especificidad y exactitud diagnósticas estuvieron entre 97 y 100 % para todos los grupos de interés, superando a los valores de los medios empleados en el diagnóstico de manera tradicional. En 14 muestras para coprocultivo se detectó el crecimiento de colonias de Salmonella enterica; de ellas 13 se confirmaron como positivas en la siembra directa en CromoCen ECCS, en un período de solo 24 h. No se observaron diferencias estadísticamente significativas para la proporción de muestras positivas detectadas en los medios CromoCen ECCS y agar SS. La única muestra positiva para Escherichia coli O157 a partir de las muestras fecales originales se detectó en el medio CromoCen ECCS y la infección causada por esta bacteria fue asociada con la de Salmonella.
Conclusión: este medio resultó útil para la identificación presuntiva de bacterias gramnegativas, como Escherichia coli O157:H7, Salmonella y Shigella, porque se lograron obtener colonias con características culturales fácilmente diferenciadas.
Palabras clave: Medio de cultivo cromogénico, identificación presuntiva, especímenes clínicos, bacterias gramnegativas.
ABSTRACT
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Background: In last few years, a wide range of chromogenic cultural media has been developed to provide useful tools for microbiological diagnostic.
Key words: Chromogenic culture medium, presumptive identification, clinical samples, Gram-negative bacteria.
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INTRODUCCIÓN
La detección e identificación temprana de los bacilos gramnegativos, sobre todo de los miembros de la familia Enterobacteriaceae, reviste gran importancia en la microbiología clínica, principalmente en el análisis de urocultivos y coprocultivos.1-4 Entre ellos, Salmonella, Shigella y las cepas de Escherichia coli patógenas, ocupan los primeros lugares como agentes etiológicos en las estadísticas de incidencia de las enfermedades diarreicas, tanto en Cuba como en el resto del mundo.5,6
Existe en la actualidad una tendencia marcada en el empleo de métodos simples, rápidos y económicos para la identificación de bacterias enteropatógenas.7
En las últimas décadas, una de las posibles soluciones a este problema ha sido el desarrollo de medios de cultivo cromogénicos y fluorogénicos.8-11 En este tipo de medios de cultivo se pueden detectar las actividades enzimáticas bacterianas, que pueden ser género o especie-específicos, mediante la incorporación de sustratos con marcadores especiales. Estos medios permiten una mejor discriminación de diferentes géneros de microorganismos en cultivos mixtos, dando como resultado una mayor eficacia en la detección, con respecto a los medios tradicionales.
En Cuba, recientemente, fue desarrollado un nuevo medio cromogénico-fluorogénico, CromoCen ECCS, para la diferenciación de Escherichia coli, Escherichia coli enterohemorrágica (O157:H7) y serovares de Salmonella enterica, de otras enterobacterias b-galactosidasa positivas y de Pseudomonas aeruginosa. Esta diferenciación se realiza según las características morfológico-culturales observadas, que incluyen el color de la colonia y la fluorescencia emitida bajo la luz UV (366 nm),12 y que se obtienen debido a la combinación adecuada de un sustrato fluorogénico de la enzima b-glucuronidasa, y de uno cromogénico de color índigo, de la b-galactosidasa; tomando como principio que el sorbitol es fermentado por la mayoría de las cepas de Salmonella enterica y no es fermentado por E. coli O157:H7. La inclusión del indicador de pH rojo neutro permite la diferenciación, pues la mayoría de las especies bacterianas en el grupo de coliformes desarrollan en este medio colonias aisladas de diferentes tonalidades de violeta, o combinación de colores verde azul con rojo. Adicionalmente, las colonias de E. coli muestran una fluorescencia azul en el medio adyacente y las colonias de E. coli O157:H7 son de color verde azul. Por otra parte, las colonias aisladas de Salmonella enterica en general desarrollan un color rojo y fluorescencia amarillenta en el centro, Shigella sonnei forma colonias verde azules con fluorescencia azul y el resto de las bacterias gramnegativas proporcionan colonias incoloras o con pigmentación propia.
El objetivo de este trabajo consistió en realizar la evaluación funcional del medio CromoCen ECCS con cultivos puros de bacterias enteropatógenas y con muestras clínicas destinadas a coprocultivo, para comparar su eficacia diagnóstica con la de los medios de cultivo tradicionalmente utilizados con esos fines.
MÉTODOS ]]>
El trabajo se realizó en el Hospital Pediátrico "Leonor Pérez" del municipio Boyeros de Ciudad de La Habana e incluyó en la fase inicial el estudio de inclusividad (sensibilidad) con los cultivos puros de cepas identificadas y el estudio de funcionalidad para el diagnóstico a partir de muestras destinadas para coprocultivo.
Cepas empleadas: se inocularon 28 cepas de Salmonella enterica y 15 de E. coli enterohemorrágica O157 en placas con medio CromoCen ECCS por el método de agotamiento por estrías. De ellas, 10 cepas provenientes de las colecciones ATCC y NCTC, fueron facilitadas por el cepario central del Centro Nacional de Biopreparados (BioCen). Las otras 33 cepas, de origen clínico, fueron aisladas en el Laboratorio de Microbiología del Hospital Pediátrico "Leonor Pérez".
Muestras clínicas: se procesaron 35 muestras fecales, 21 de rutina de laboratorio y 14 tomadas a pacientes ingresados por causa de un brote de infección alimentaria. Otras 33 muestras para coprocultivo, seleccionadas aleatoriamente, se inocularon con 0,2 mL de suspensiones de diferentes cepas de bacterias enteropatógenas: 16 con Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150, una con Shigella sonnei ATCC 25931, 7 con Salmonella typhi ATCC 7251, 2 con cada uno de los serogrupos de Salmonella enterica (B, C1, C2 y D) y una con S. enterica grupo E. Para obtener estas suspensiones, cada cepa almacenada sobre plano inclinado de agar triptona soya (BioCen, Cuba) se inoculó en el caldo triptona soya (Lote 2500004, BioCen, Cuba) y se incubó durante 24 h a 37 °C. Estas muestras se procesaron por la técnica de coprocultivo antes y después de contaminación, en paralelo.
Todas las muestras se analizaron por el método de siembra directa por estriado en el medio CromoCen ECCS (Lote 2500001, BioCen, Cuba), agar SS (Lote 6007, BioCen, Cuba) y agar MacConkey (Lote 5012, BioCen, Cuba). Los medios inoculados se incubaron a 35 °C por un tiempo no mayor de 24 h debido al posible cambio de color de las colonias. Para la detección de Salmonella enterica, en paralelo, se realizó el procedimiento con enriquecimiento selectivo y aislamiento posterior en los medios CromoCen ECCS y agar SS El enriquecimiento consistió en la inoculación de una asada de cada muestra fecal en 9 mL del caldo Rappaport-Vassiliadis (Lote V281512, Merck, Alemania) e incubación por 24 h a 37 °C.
Identificación presuntiva: en la primera fase del estudio solo se realizó la caracterización detallada de las colonias desarrolladas en el medio CromoCen ECCS, después de la inoculación de las cepas de identidad conocida. Todas las placas se examinaron por el mismo analista. La identificación presuntiva a partir de las muestras clínicas se hizo mediante el análisis de las características culturales de las colonias aisladas en los medios CromoCen ECCS y de referencia. Como colonias de Salmonella enterica se consideraron las rojas o rojas con el centro claro y fluorescencia amarilla en el medio cromogénico, y colonias incoloras translúcidas, con centro negro o sin este, en el medio agar SS. Las colonias verde azules sin fluorescencia bajo luz UV de 366 nm, en el medio CromoCen ECCS, fueron consideradas como sospechosas de E. coli O157:H7, y las colonias rojas con precipitado biliar en agar MacConkey se consideraron como E. coli, en general.
Identificación confirmativa: de cada placa analizada del medio CromoCen ECCS se seleccionaron hasta 5 colonias con diferentes características morfológico-culturales, y en los medios agar SS y agar MacConkey se seleccionaron las colonias rojas e incoloras.
Para su identificación confirmativa se utilizaron las pruebas bioquímicas siguientes: crecimiento en los medios agar hierro de Kligler, agar lisina y hierro, producción de indol, motilidad, utilización del citrato de sodio y de urea. Se realizaron, a algunas colonias adicionalmente, las pruebas de descarboxilación de arginina, ornitina y glutamato, Voges-Proskauer, rojo de metilo, hidrólisis de esculina, fermentación de sorbitol, manitol, ramnosa, adonitol, dulcitol y prueba de oxidasa. La preparación de los medios para realizar estas pruebas se efectuó según las técnicas estándares,13 con el empleo de los medios de cultivo deshidratados de BioCen y reactivos comerciales de Merck y Applichem (Alemania).
Para la confirmación de Salmonella enterica se utilizaron los antisueros polivalente y grupo-específicos (Empresa de Producción de Biológicos [EPB] "C.J. Finlay", Cuba), para S. typhi, además, el antisuero "Vi" (EPB "C.J. Finlay", Cuba) y para E. coli sorbitol-negativas, la prueba de latex con antisuero O157 (Oxoid, Inglaterra).
Procesamiento de los resultados: el cálculo de la sensibilidad para el diagnóstico de E. coli O157 y de Salmonella enterica se basó en los resultados obtenidos con los cultivos puros de cepas de colección y de origen clínico. Los cultivos de cepas con características culturales típicas para el grupo en estudio, se consideraron como verdaderamente positivos (VP) y los cultivos de cepas con características atípicas, como falsos negativos (FN). ]]>
Los valores estimados de sensibilidad, especificidad y exactitud diagnósticas, para la identificación de colonias bacterianas aisladas a partir de muestras fecales, se determinaron por las ecuaciones descritas por Havelaar y otros14 y los límites del 95 % de confianza para estas proporciones se calcularon según Ilstrup.15 Estos indicadores de calidad diagnóstica se determinaron, tanto para los medios de cultivo de referencia como para el medio CromoCen ECCS.Para la comparación estadística de la proporción de muestras positivas, obtenidas por los diferentes métodos microbiológicos estudiados (de referencia y alternativo- CromoCen ECCS) respecto al total de muestras positivas, se empleó la prueba de McNemar para datos nominales pareados.16 Se calculó el valor del estadígrafo para la distribución de c2 y la probabilidad de que exista diferencia significativa entre los métodos comparados.
RESULTADOS
Los resultados de la siembra de los cultivos puros bacterianos en el medio cromogénico mostraron que las 28 cepas desarrollaron colonias con características típicas, pero 2 de ellas mostraron además fluorescencia azul (tabla 1), lo que corresponde a 92,8 % de sensibilidad. Las 15 cepas de E. coli enterohemorrágica (O157) manifestaron las características típicas para este serotipo, color verde azul de la colonia y ausencia de fluorescencia por lo que, en este caso, la sensibilidad para su diagnóstico alcanzó 100 %.
Por otra parte, mediante el procedimiento de coprocultivo se aislaron 17 cepas de bacterias enteropatógenas en 35 muestras fecales. En las 14 muestras provenientes de pacientes ingresados por causa de un brote de infección alimentaria, se aisló Salmonella enterica grupo D. Adicionalmente, una cepa de Salmonella enterica grupo B se aisló de una muestra de rutina (tabla 2). Esta última cepa se detectó en ambos medios de cultivo solo después de enriquecimiento selectivo en caldo Rappaport-Vassiliadis. Del resto de las 14 muestras positivas, se detectó S. enterica en el CromoCen ECCS en 13 muestras, tanto por el procedimiento de siembra directa como después del enriquecimiento selectivo. En agar SS este microorganismo se detectó en las 14 muestras, aunque en una de ellas, únicamente a partir de la resiembra desde el caldo Rappaport-Vassiliadis y en otra solo mediante siembra directa. La proporción de muestras positivas detectadas por los diferentes procedimientos empleados, respecto al total de muestras positivas por ambos medios, fue estadísticamente no diferente (p= 0,48). ]]>
Las 33 muestras artificialmente inoculadas arrojaron resultados negativos antes de la contaminación, mientras que después de esta, todas las cepas de bacterias enteropatógenas fueron detectadas mediante aislamiento directo, sin enriquecimiento. Todas presentaron las características descritas en el medio CromoCen ECCS y su identificación se confirmó mediante la aplicación de pruebas serológicas a las colonias sospechosas, tomadas directamente de las placas de aislamiento primario. No se observaron resultados falsos negativos (colonias confirmadas como Salmonella enterica con características culturales atípicas), ni falsos positivos (colonias de otras bacterias con características típicas de Salmonella enterica); por lo que todos los indicadores de calidad diagnóstica alcanzaron los valores de 100 % (tabla 3). Sin embargo, la sensibilidad, la especificidad y la exactitud para la detección de esta bacteria enteropatógena en agar SS presentaron los valores estimados de 100; 50,9 y 67,5 %, respectivamente.
E. coli O157:H7 se detectó solo en una muestra naturalmente contaminada de la cual también se aisló Salmonella enterica del Grupo D.
Los valores de sensibilidad, especificidad y exactitud diagnósticas en la identificación de E. coli enterohemorrágica fueron de 100; 97,4 y 97,8 %, respectivamente (tabla 3). Se detectaron 4 resultados falsos positivos que consistieron en aislamientos de colonias con características culturales típicas de E. coli O157:H7, identificadas como Enterobacter spp. La aplicación adicional de la prueba rápida de glutamato descarboxilasa (GAD) a las colonias sospechosas posibilitó una confirmación rápida y específica de E. coli, lo que permitió incrementar la especificidad del procedimiento de identificación en general. El agar MacConkey mostró solo 83,3 % de sensibilidad, 50,0 % de especificidad y 71,4 % de exactitud diagnóstica para la detección de todos los serotipos de E. coli de forma inespecífica.
DISCUSIÓN
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La especie que con mayor frecuencia se aisló de las muestras de heces fecales fue Salmonella enterica, porque un número importante de las muestras clínicas incluidas en este trabajo procedían de un brote de intoxicación alimentaria ocurrido durante el período de estudio. Aunque en la mayoría de los casos las cepas de este patógeno intestinal fueron aisladas por siembra directa, hubo una muestra donde esta se pudo recuperar solo después de la resiembra en caldo Rappaport-Vassiliadis, lo que confirma la necesidad de enriquecimiento previo, para esta especie bacteriana.1,17,18 En varios estudios realizados con otros medios de cultivo para detección de Salmonella enterica, tanto cromogénicos como los tradicionalmente utilizados, se han observado diferencias significativas entre la recuperación de las muestras positivas, antes y después del paso de enriquecimiento selectivo.19,20 Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio se basan sobre todo en las muestras con alta concentración de células de Salmonella, porque la inmensa mayoría de ellas provenía de los casos del brote de infección, por lo que el paso de enriquecimiento no influyó significativamente en la recuperación de las cepas.El empleo de diferentes cepas de S. enterica demostró que la mayoría de ellas tienen habilidad de formar en el medio CromoCen ECCS colonias típicas, rojas con centro claro o sin este, incluidas las cepas de serotipos Typhi y Paratyphi. Esta cualidad del medio le ofrece ventajas frente a los
medios de cultivo convencionales y a algunas otras formulaciones de medios cromogénicos desarrollados anteriormente, donde los serotipos Typhi y Paratyphi están excluidos de su propósito diagnóstico.1,18,21
La proporción de las colonias positivas confirmadas como Salmonella enterica en las muestras fecales fue muy superior en el medio CromoCen ECCS que en el agar SS, independientemente de que la sensibilidad diagnóstica en ambos medios de cultivo alcanzó 100 %. Esto se debe a que la producción de gas sulfhídrico, en el cual se basa la diferenciación de Salmonella en agar SS, es una característica inespecífica, por lo que otras especies bacterianas presentes en las heces proporcionan resultados falsos positivos. Además, todos los resultados positivos en el medio CromoCen ECCS se observaron solo con 24 h de incubación, mientras que un estudio realizado con el medio Cromagar Salmonella informa que solo 67 % de las cepas aisladas de S. enterica desarrollaron características típicas con 24 h.18
El agar MacConkey, que se emplea en el diagnóstico clínico en Cuba para la detección de las cepas patógenas de E. coli, también es muy poco específico, porque la fermentación de lactosa es una característica común tanto para las cepas patógenas como para las inocuas en el tracto intestinal. Por ello, el medio cromogénico se puede considerar como una nueva herramienta útil para la detección de E. coli O157:H7, porque este medio aumenta considerablemente la especificidad en la identificación del microorganismo mencionado respecto a los procedimientos convencionales. Sin embargo, hay que tener en cuenta que este diagnosticador está destinado solo para uno de los serotipos responsables de producción de verotoxinas y, además, la confirmación del diagnóstico debe realizarse con pruebas serológicas y de toxigenicidad.22 No obstante, la efectividad de los resultados de pesquisa durante el aislamiento, permite prescindir del empleo innecesario de pruebas bioquímicas (fermentación de sorbitol) y de procedimientos costosos para la confirmación. Además, en el medio CromoCen ECCS fue posible detectar las infecciones asociadas de E. coli enterohemorrágica O157 y S. enterica mediante siembra directa en una sola placa, mientras que los procedimientos de rutina emplean 2 medios de cultivo diferentes para su aislamiento. Según los resultados de un estudio de la etiología bacteriana de las diarreas en niños, realizado en el Hospital Pediátrico "Juan Manuel Márquez", las infecciones provocadas por E. coli O157 en 13 % de los casos estuvieron asociadas con otros patógenos entéricos, de ellas, la mayoría con Salmonella enterica,23 lo que confirma la utilidad del medio cromogénico para este diagnóstico.
Las colonias de Shigella sonnei fueron fácilmente reconocibles entre la microbiota normal de intestino, por su tamaño, el color verde azul y la fluorescencia azul, bajo luz UV de 366 nm.
Aunque el CromoCen ECCS no es específico para Shigella, las cepas de S. flexneri grupo A, aisladas de 2 muestras de coprocultivo de forma natural, se identificaron con facilidad debido a la fluorescencia azul de las colonias de color rosa pálido, porque de las colonias que tienen este tipo de coloración, solo algunas cepas de Shigella flexneri pueden emitir fluorescencia azul, según los datos reportados por otros investigadores.24,25
Mediante el empleo del medio CromoCen ECCS fue posible la identificación presuntiva de diferentes microorganismos patógenos intestinales por el procedimiento de siembra directa con alta fiabilidad y en solo 24 h de incubación, y en ocasiones con la ayuda adicional de pruebas rápidas y fáciles de realizar. En contraste, utilizando los métodos de rutina, empleados en la actualidad, se necesitan al menos 72 h. Los datos de la identificación presuntiva, que se obtuvieron en la mayoría de los casos directamente del cultivo primario, facilitaron la orientación del analista para la selección de las pruebas que condujeron a una identificación confirmativa. En conclusión, el medio CromoCen ECCS puede ser recomendado para su uso en el aislamiento primario de Salmonella y E. coli O157:H7, a partir de muestras fecales.
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Recibido: 4 de enero de 2007.
Aprobado: 27 de agosto de 2007.
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Dra. Anna Tsoraeva. Centro Nacional de Biopreparados. Carretera a Beltrán, km 1 1/2, Bejucal, La Habana, Cuba. Tele/fax: 047-682835. Correo electrónico:atsoraeva@biocen.cu