Identificación de serotipos del virus dengue circulantes en el estado de Campeche, México
Identification of dengue virus serotypes circulating in Campeche state, Mexico
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Tayde J. Sosa CabreraI; Mayling Álvarez VeraII; Selene del Carmen Blum DomínguezIII; Hilda Salicorrea OrtegónIVI Licenciada en Medicina. Profesora e Investigadora Titular. Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales. Universidad Autónoma de Campeche, México.
II Licenciada en Microbiología. Máster en Virología. Investigadora Auxiliar. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba.
III Licenciada en Química Farmacéutica y Biología. Máster en Microbiología. Investigadora Agregada. Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales. Universidad Autónoma de Campeche, México.
IV Licenciada en Química Farmacéutica y Biología. Investigadora Auxiliar. Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales. Universidad Autónoma de Campeche, México.
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RESUMEN
INTRODUCCIÓN: el dengue en la actualidad es una arbovirosis que está impactando a los países latinoamericanos, y México no ha sido la excepción, donde de ser una región hipoendémica ha evolucionado a hiperendémica por la múltiple circulación de los serotipos.
OBJETIVOS: determinar la seroprevalencia de los virus del dengue en el Estado de Campeche, México e identificar los serotipos circulantes en los diferentes municipios que conforman el estado.
MÉTODOS: para este estudio se emplearon los métodos de ELISA de inhibición y la prueba de neutralización por reducción del número de placas.
RESULTADOS: de un total de 600 muestras obtenidas, 67,5 % (405) presentó anticuerpos IgG contra virus dengue y 32,5 % (195) resultó negativo. Con respecto a los serotipos se detectó que 32,3 % tuvo una infección primaria con predominio del serotipo DEN-1 y 68 % infección secundaria; prevaleció la secuencia DEN-1/ DEN-2 y DEN-3/ DEN-4 en 9 municipios. El grupo de edad en el que fue más frecuente la infección a los 4 serotipos resultó el de 21 a 30 años. El serotipo que resultó con mayor circulación en el estado fue DEN-1.
CONCLUSIONES: la seroprevalencia y la frecuencia de infección secundaria observada en niños y adultos, indica la elevada circulación de los virus en el Estado; este resultó un factor epidemiológico importante para la aparición de brotes epidémicos y de las formas graves de la enfermedad.
Palabras clave: Dengue, serotipos, México.
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ABSTRACTBACKGROUND: at present, dengue is an arbovirosis that is greatly affecting the Latin American countries, and Mexico is not the exception, where a hypoendemic region has evolved into a hyperendemic area because of the circulation of multiple serotypes.
OBJECTIVES: to determine the seroprevalence of dengue virus in Campeche state, Mexico, and to identify the circulating serotypes in its various municipalities.
METHODS: inhibition ELISA and plate reduction neutralizing test were the methods used in this study.
RESULTS: of 600 samples, 67.5 % (405) had IgG antibodies to dengue virus whereas 32.5 % (195) were negative. Regarding the serotypes, 32.3 % had primary infection with serotype DEN-1 and 68 % showed secondary infection; the prevailing sequence was DEN-1/DEN-2 and DEN-3/DEN-4 in 9 municipalities. The infection with the 4 serotypes was mostly found in the 21-30 y age group. The most circulating serotype was DEN-1 throughout the state.
CONCLUSIONS: seroprevalence and frequency of secondary infection observed in children and adults indicated an increased circulation of virus in the state and this was considered an important epidemiological factor for the emergence of outbreaks and the most severe forms of the disease.
Key words: Dengue, serotypes, Mexico.
]]> INTRODUCCIÓN
El dengue es producido por un ARNvirus de la familia Flaviviridae, que se transmite mediante la picadura del mosquito Aedes aegypti, se han identificado otros mosquitos transmisores como Aedes albopictus y Aedes scutellaris.1 El continente americano enfrenta ahora un alarmante panorama de epidemias de fiebre hemorrágica por dengue (FHD) que se disemina de un país a otro, cuyo primer indicador de alarma fue documentado en Cuba en 1981, cuando se presentó la primera epidemia importante de FHD en el continente americano, en la que se reportaron 344 203 casos de FD, 10 312 de FHD y 158 defunciones.2 En el año 2000, 27 países en Latinoamérica, países del Centro, Sur América y el Caribe reportaron transmisión por dengue, de estos, 17 países tuvieron casos de FHD y 10 registraron muertes por FHD/SCD; siendo los países más afectados Brasil, Ecuador, Colombia, Paraguay y Venezuela.3 Al transformarse la región de hipoendémica a hiperendémica en las zonas tropicales del Continente Americano, por causa de la circulación de los 4 serotipos del virus dengue.4,5
En México la emergencia del dengue ocurrió en 1978 con la introducción del serotipo 1, que se diseminó por todo el país en menos de 10 años, lo cual sensibilizó a un alto número de individuos para desarrollar una infección secundaria y aumentó el riesgo de FHD, por lo que se produjeron importantes brotes epidémicos. En 1995 con la introducción de los serotipos 2 y 4 inició la primera epidemia de dengue hemorrágico, se reportaron 539 casos, y para 1996 se incrementó a 1 456 con la introducción del serotipo 3,6 con una rápida diseminación, lo que ocasionó brotes de dengue hemorrágico en 20 de los 31 estados del país.7
En Campeche en 1979 se registró la presencia del Aedes aegypti, 1 año después se detectaron los primeros casos de FD, y en 1995 se reportaron 2 casos de FHD.8
Son pocos los estudios realizados para determinar la circulación de los serotipos del virus del dengue en la región, por lo que en este trabajo se determinó la distribución y la presencia de infecciones secundarias en la población del estado de Campeche.
MÉTODOS
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Para determinar el número de muestras a estudiar se realizó un muestreo estratificado,9 en el que se dividió a la población en subpoblaciones llamadas estratos (municipios). El tamaño de la muestra se obtuvo por el método de estimación de proporciones,10 primero una muestra independiente de cada estrato y posteriormente se reunió la información para obtener las estimaciones globales de la población. Se estudiaron 600 muestras de todo el estado, para 99 % de confianza. El número de muestras por municipio se correspondió con el total de habitantes del municipio entre el total de habitantes del estado por el número total de muestras a obtener. En la tabla 1 se puede observar el número de muestras estudiadas por municipios.
Toma de muestra
Se utilizó el método de sangre entera absorbida en papel filtro.11
Procedimiento ]]>
Se puncionó el dedo índice con una lanceta y la sangre se dejó absorber sobre el papel filtro (blood sampling paper, NOBUTO, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japón), hasta dejar ambos lados impregnados. Se dejó secar la sangre a temperatura ambiente y se colocó el papel filtro en posición vertical. Se eluyeron durante toda la noche a 4 °C en 400 µL de solución de PBS que contenía albúmina bovina a 0,5 %, lo que correspondía a una dilución del suero de 1/10, estas muestras fueron guardadas en frío hasta su procesamiento.
ELISA de inhibición
Todas las muestras obtenidas fueron procesadas por el método de ELISA de inhibición (MEI), para la detección de anticuerpos IgG contra virus dengue, siguiendo el procedimiento recomendado por Vázquez y otros.12 Fueron sensibilizadas placas de poliestireno (Nunc) con Ig humanas anti-dengue (Laboratorio de Arbovirus del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" [IPK]) a una concentración de 10 µg/mL en solución de carbonato/bicarbonato pH 9,5, y se dejaron en incubación a 4 °C durante 18 h; posteriormente se bloqueó con albúmina bovina 1 % durante 1 h a 37 °C. Se lavó la placa 3 veces en buffer fosfato-salina (PBS) pH 7,2 y Tween 20 a 0,05 %, se adicionó el antígeno DEN-2 a una dilución 1/40 con PBS-T. Seguida de una incubación de 1 h, se lavó la placa 3 veces con PBS-T, y se agregaron los sueros en estudio, en diluciones 1/20 en PBS-T, al igual que los sueros controles. Se utilizó un control de suero humano negativo de anticuerpos a dengue y uno positivo en iguales condiciones que las muestras (positivo por duplicado y negativo por cuadruplicado) y se incubaron durante 1 h a 37 °C. Se lavó la placa 3 veces en PBS-T, después se adicionó el conjugado anti-dengue-peroxidasa (Laboratorio de Arbovirus del IPK) diluido 1/8000 con PBS-T y 2 % de suero de ternero; se dejó incubando 1 h a 37 °C, se lavó la placa 3 veces con PBS-T, y se agregó el sustrato ortofenilendiamina (Sigma) y peróxido de hidrógeno. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico, se realizaron las lecturas en un lector (Multiskan) a 492 nm. Se consideraron positivos aquellos sueros que presentaron un porcentaje de inhibición mayor o igual que 50 % en relación con el control negativo.
Líneas celulares ]]>
Línea celular BHK-21 clono 15 (riñón de hámster) donada al Laboratorio de Arbovirus del IPK por el profesor SB Halstead (Director Científico de la vacuna pediátrica de dengue) fue empleada para la técnica de neutralización por reducción del número de placas. Estas células fueron crecidas a 37 ºC en frascos de 75 cm2 utilizando medio MEM (medio mínimo esencial) suplementado con 1 % de aminoácidos no esenciales (100x) y 10 % de suero fetal bovino inactivado. Para la realización de la técnica se preparó una suspensión celular a una concentración de 2 x 105 células/mL.
Línea celular C6/36 HT (Aedes albopictus), donada al Laboratorio de Arbovirus del IPK por el doctor Javier Díaz del Laboratorio Departamental de Medellín, Colombia. Estas células fueron empleadas para la preparación de los lotes virales que se utilizaron en la neutralización por reducción del número de placas (NRNP). Las células se mantuvieron mediante pases semanales utilizando medio de crecimiento MEM suplementado con 1 % de aminoácidos no esenciales (100x), 2mM de glutamina, antibióticos (penicilina 100 UI/mL y estreptomicina 100 mg/mL) y 10 % de suero fetal bovino inactivado.
Cepas
Las cepas empleadas para la NRNP fueron las siguientes:
DEN-1 Angola 4PC6/36 2PVero
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DEN-4 Dominicana 4PC6/36 2PVero 5PC6/36 HT
Neutralización por reducción del número de placas (NRNP)
La presencia de anticuerpos neutralizantes en las muestras se determinó siguiendo la metodología de Morens y otros13 y Álvarez y otros.14 Las muestras de suero fueron diluidas 1/30 a una dilución específica 1/30, frente a una dilución constante de virus que contenía 40 unidades formadoras de placas (ufp) en 100 uL. En este caso se obtuvo el porcentaje de reducción de placas para la dilución de suero empleada, lo cual indicaría si el suero tiene o no anticuerpos. Cuando este porcentaje de reducción es ³ 50 % se consideró que el suero era positivo, es decir presentaba anticuerpos.
Se determinó en las muestras la presencia de los anticuerpos neutralizantes a los 4 serotipos del virus dengue en células BHK21, con el empleo para el serotipo DEN-1 de la cepa Angola 4PC6/36 2PVERO; al serotipo DEN-2 la cepa A15 4PR 1PC6/36; con el serotipo DEN-3 la cepa 116/00 2PC6/ 36 y para el serotipo DEN-4 la cepa Dominica 4PC6/36 2PVero 5PC6/36.
Los sueros fueron tratados con cloroformo para su esterilización y después diluidos 1/30 en medio de mantenimiento. Las cepas virales se prepararon a una dilución que contenía 40 ufp/100 µL. Cada suero se mezcló con igual volumen de dilución de cada cepa viral. Las mezclas se incubaron durante 1 h a 37 ºC en ambiente de CO2 a 5 %. Posteriormente 50 µL de cada una de las mezclas virus-suero y de los controles virales fueron inoculadas en 500 µL de suspensión de células BHK-21 clono 15 sembradas en placas de 24 pozos a una concentración de 2 x 105 células/mL. Se incubaron durante 4 h a 37 ºC en atmósfera de CO2 a 5 %. Después de este tiempo se añadió medio de recubrimiento a razón de 500 µL por pozo y las células fueron incubadas durante el tiempo correspondiente para cada cepa como se señaló antes. ]]>
RESULTADOS
Los resultados obtenidos en este trabajo indican que 67,5 % de la población del estado de Campeche se ha infectado con los virus del dengue. En la figura puede observarse la prevalencia en los 11 estratos estudiados, en el que se refleja la presencia de anticuerpos a virus dengue encontrada en los municipios del Norte (Calkiní, Tenabo y Hecelchakán), Centro (Campeche, Champotón y Hopelchén) y Sur (Carmen, Escárcega, Candelaria, Calakmul y Palizada) del estado. Los municipios con una mayor prevalencia de anticuerpos fueron: Calkiní, Hecelchakán, Campeche, Carmen y Champotón.
De los positivos a dengue 32,3 % (131/405) individuos tuvieron una infección primaria y 68 % (274/405) presentó infección secundaria por 2 serotipos o más. La prevalencia de infección por DEN-1 resultó la más elevada con 21,5 % (87/405), le siguió la prevalencia del DEN-3 con 4 % (16/405). Empleando la prueba Ji (X2) se obtuvo una diferencia altamente significativa con una p< 0,01. El DEN-2 con 3,7 % (15/405) y el DEN-4 con 3,2 % (13/405). Se observó un mayor porcentaje de personas con infección secundaria en los municipios de Campeche, Carmen, Champotón, Calkiní y Escárcega, que resultó más frecuente en el sexo femenino con 62,7 % (254/405) (tabla 2).
La frecuencia de infección por DEN-1 predominó en todos los grupos etáreos, resultando más frecuente en el rango de edad de 21 a 30 años (tabla 1), lo cual permite inferir que la población susceptible a este serotipo ha disminuido. En niños fue más frecuente la infección por DEN-1, seguida por el DEN-3 y el DEN-2.
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DISCUSIÓN
El dengue está expandiéndose en las Américas con la circulación secuencial de múltiples serotipos,15 ocasionando en los últimos años severas epidemias, así como el desarrollo de períodos hiperendémicos, panorama que podría presentarse, a muy corto plazo, en el estado de Campeche.
En este estudio se empleó el método de sangre entera absorbida en papel filtro por las ventajas que ofrece en los estudios serológicos, por ser un método sencillo, económico y rápido. Entre las principales ventajas se encuentra la facilidad para obtener la muestra de sangre, especialmente en niños y en personas que resulta difícil la extracción de sangre venosa, así como su fácil transporte y almacenamiento.11
La seroprevalencia encontrada en este trabajo de 67,5 % demuestra que una proporción muy alta de la población ha estado expuesta al dengue en el estado, se observa que fue más elevada en adultos jóvenes (21 a 30 años). Resultados similares han sido reportados en Brasil donde se encontró 69 %,16 y Perú con valores de hasta 66 %17 lo que sugiere la elevada circulación de los virus del dengue en Centro y Sur América.
La presencia de infección secundaria detectada en niños y adultos, indica la alta circulación de los virus del dengue en el Estado, lo que podría considerarse un factor epidemiológico importante para la aparición de brotes epidémicos de las formas graves de la enfermedad, como ha sido referido por otros autores,18 quienes han señalado que la infección secundaria es el principal factor de riesgo de FHD/SCD y que este se incrementa hasta 15 veces cuando el segundo serotipo es el DEN-2.19
En años recientes (2002-2005), se ha visto el incremento de casos de FD y FHD en niños y adultos, infecciones causadas por el serotipo DEN-2, por lo tanto, no podría descartarse que pudiera ser por causa de la introducción de un nuevo genotipo del virus DEN-2 que ha estado circulando en la región.20,21
En Campeche, al igual que otros estados del país el dengue constituye una enfermedad endémica en algunas zonas donde permanece el vector, en los últimos años el nivel ascendente de los casos reportados se ha debido principalmente a los serotipos DEN-3 y DEN-2, que ubica al dengue como la primera enfermedad emergente en el estado.
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Recibido: 29 de noviembre de 2006.
Aprobado: 4 de junio de 2008.
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Dra. Tayde J. Sosa Cabrera. Universidad Autónoma de Campeche, México. Calle 55 No. 31 Centro. Campeche, México. CP 24000. Teléf.: 00 981 81 6 40 03. Correo electrónico: taydesosa@hotmail.com
Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales ]]>