Evaluación antileishmanial in vitro de extractos provenientes de Citrus limetta, Cucurbita maxima y Rhoeo spathacea
In vitro anti-leishmanial evaluation of extracts from Citrus limetta, Cucurbita maxima y Rhoeo spathacea
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Marley García ParraI; Lianet Monzote FidalgoII; Ana Margarita Montalvo ÁlvaresIII; Ramón Scull LizamaIV
I Máster en Parasitología. Reserva Científica. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Ciudad de La Habana, Cuba.
II Máster en Farmacología. Investigadora Agregada. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
III Licenciada en Biología. Investigadora Titular. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
IV Máster en Ecología. Investigador Agregado. Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, Cuba.
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RESUMEN
INTRODUCCIÓN: la leishmaniosis comprende un grupo de enfermedades infecciosas causadas por organismos hemoflagelados del género Leishmania. Hoy día, esta enfermedad prevalece en 88 países tropicales alrededor del mundo y existe un estimado de 1,5 a 2 millones de nuevos casos por año. Su control es deficiente, principalmente al no contar con una vacuna eficaz. Aunque existen varios fármacos para su tratamiento, todos requieren una administración parenteral, tratamientos muy largos, costosos, y causan una alta toxicidad al organismo. El programa de enfermedades tropicales de la Organización Mundial de la Salud considera la investigación de plantas como una esencial prioridad para el tratamiento de Leishmania.
OBJETIVO: evaluar la actividad antileishmanial de extractos provenientes de Citrus limetta, Cucurbita maxima y Rhoeo spathacea.
MÉTODOS: en este trabajo se utilizó una cepa de Leishmania amazonensis agente causal de la leishmaniosis cutánea. Se determinó la actividad de los extractos frente a los estadios de promastigote y amastigote del parásito, así como frente a macrófagos peritoneales de ratón BALB/c, para valorar su posible toxicidad.
RESULTADOS: los extractos provenientes de Curcubita maxima y Rhoeo spathacea fueron los que mostraron un mayor porcentaje de inhibición del crecimiento frente a promastigotes. Frente a amastigotes también mostraron una buena actividad antileishmanial, mientras que su citotoxicidad fue moderada con un índice de selectividad de 3. ]]>
CONCLUSIONES: solo los extractos de Curcubita maxima y Rhoeo spathacea fueron los que mostraron una actividad antileishmanial.
Palabras clave: Leishmania amazonensis, extractos de plantas cubanas, Citrus limetta, Cucurbita maxima, Rhoeo spathacea.
ABSTRACT
BACKGROUND: leishmaniosis covers a group of infectious diseases caused by Leishmania genus hemoflagellate organisms. At present, this disease is prevailing in 88 tropical countries worldwide; it is estimated that 1.5 to 2 million new cases will occur every year. The control of the disease is deficient, mainly because there is no effective vaccine available. Although several drugs for treatment exist, all of them require parenteral way of administration, delayed and costly therapies and cause high toxicity. The tropical disease program of the World Health Organization considers plant research as an essential priority for Leishmania treatment.
OBJECTIVE: to evaluate the antileishmanial action of extracts from Citrus limetta, Cucurbita maxima y Rhoeo spathacea.
METHODS: aLeishmania amazonensis strain, the causative agent of cutaneous leishmaniosis, was used in this paper. The extract effect on the stagings of promastigot and amastigot of the parasite as well as on the peritoneal macrophages from BALB/c mouse was determined to assess its possible toxicity.
RESULTS: Curcubita maxima y Rhoeo spathacea showed higher percentage of growth inhibition in promastigots. Good anti-leishmanial activity was also observed against amastigots, whereas its citotoxicity was moderate, with a selectivity index of 3.
CONCLUSIONS: Curcubita maxima y Rhoeo spathacea extracts were the only ones that had anti-leishmanial activity. ]]>
Key words: Leishmania amazonensis, Cuban plant extracts, Citrus limetta, Cucurbita maxima, Rhoeo spathace.
INTRODUCCIÓN
La leishmaniosis ha sido considerada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como un problema de salud pública en África, Asia y América Latina. Las estadísticas de esta organización revelan que existen aproximadamente más de 12 millones de personas afectadas, con una frecuencia de 1,5 a 2 millones de nuevos casos por año y más de 350 millones de personas viven en riesgo de contraer la enfermedad.1,2 En el hombre se pueden desarrollar 3 formas clínicas de la leishmaniosis: leishmaniosis cutánea, leishmaniosis mucocutánea y leishmaniosis visceral. En América Latina la forma cutánea es la más abundante y produce lesiones dérmicas que pueden llegar a ulcerarse.3
Hasta el momento, no se cuenta con una vacuna eficaz, por lo que no existe control de la enfermedad por esta vía.3,4 En áreas endémicas, la quimioterapia constituye la principal medida para el control de la leishmaniosis. Entre las drogas empleadas para combatir esta enfermedad se encuentran en primer lugar, los derivados de antimonio pentavalente, y como drogas de segunda línea se emplean la anfotericina B y sus formulaciones lipídicas, la pentamidina y la aminosidina. A pesar de su eficacia, todos estos fármacos requieren administración parenteral, los tratamientos son muy largos, costosos, y causan una alta toxicidad al organismo.5 Recientemente, se introdujo la miltefosina, que resulta la única droga administrada por vía oral para el tratamiento de la leishmaniosis visceral, aunque es teratogénica y altamente costosa.5,6 Por causa de todas estas limitantes, es de gran interés y urgencia encontrar nuevos fármacos que presenten una mayor eficacia y accesibilidad para los pacientes.
Los productos naturales constituyen una fuente ilimitada de obtención de productos químicos para la identificación de nuevas drogas. En áreas endémicas se utiliza un gran número de plantas medicinales para el tratamiento de las enfermedades infecciosas. El Programa de Enfermedades Tropicales de la OMS ha considerado la investigación de plantas como una prioridad esencial para el tratamiento de la leishmaniosis.7,8 Con el objetivo de ampliar la búsqueda de nuevos agentes antileishmaniales, se evaluó in vitro extractos de 3 plantas cubanas frente a L. amazonensis.
Para la determinación de la actividad leishmanicida se utilizó una cepa de L. amazonensis (MHOM/77/LTB0016), donada por el Departamento de Inmunología de la Fundación Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil. Los parásitos fueron mantenidos en medio Schneider (SIGMA, St. Louis, MO, EUA), suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 µg/mL) y 10 % de suero fetal bovino (SIGMA, St. Louis, MO, EUA) inactivado con calor (56 ºC, 30 min). ]]>
Las plantas fueron colectadas en el Jardín Botánico Nacional, Ciudad de La Habana, Cuba, en 2006. Para la preparación de los extractos hidroalcohólicos se seleccionaron las hojas de las plantas, con excepción de la especie Cucurbita maxima, de la cual se emplearon las semillas. Los extractos fueron preparados por maceración durante 7 d, usando etanol 80 % como menstruo.9 Los extractos fueron secados, liofilizados y almacenados a - 20 ºC.Para el ensayo en promastigotes de L. amazonensis se emplearon 2 concentraciones de cada extracto (50 y 100 mg/mL). Los extractos se adicionaron a cultivos de promastigotes que se encontraban a razón de 105 parásitos/mL y se incubaron durante 72 h a 26 ºC. Posteriormente, se midió la actividad de la fosfatasa alcalina y los resultados se expresaron como porcentaje de inhibición del crecimiento en comparación con los controles. Los productos que mostraron una inhibición del crecimiento mayor que 50 % a una concentración de 100 mg/mL, fueron evaluados frente a amastigotes de L. amazonensis y sobre macrófagos peritoneales de ratones BALB/c.
Para el ensayo en amastigotes se extrajeron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c y se infectaron con promastigotes estacionarios de L. amazonensis a razón de 4 parásitos por macrófago10 y fueron tratados con 1 mL de cada extracto a diferentes concentraciones. Después de 48 h de incubación a 37 ºC y 5 % CO2, se hicieron conteos directos en cultivos teñidos por Giemsa, para determinar la concentración inhibitoria media (CI50) mediante una curva de regresión lineal.
Para evaluar la toxicidad de los extractos se extrajeron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c y fueron tratados con los extractos a diferentes concentraciones durante 48 h. La actividad se determinó por un método colorimétrico usando solución de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT, SIGMA, St. Louis, MO, EUA),11 y se determinó la CI50. Finalmente, se calculó el índice de selectividad (IS).
Se empleó como droga de referencia la pentamidina (Richet, Buenos Aires, Argentina), la cual es un fármaco convencional empleado en el tratamiento de la leishmaniosis.
Los extractos de Cucurbita maxima y Rhoeo spathacea fueron los que mostraron un mayor porcentaje de inhibición del crecimiento en promastigotes de L. amazonensis a 100 µg/mL (tabla 1). Estas 2 especies mostraron además, una buena actividad antileishmanial frente a amastigotes de L. amazonensis y presentaron una citotoxicidad moderada con índices de selectividad de 3 (tabla 2).
La especie Cucurbita maxima, conocida comúnmente como calabaza, ha sido estudiada en numerosas ocasiones.12-16 Las semillas contienen propiedades vermífugas, y el principio activo, se cree que es la fitosterolina.12 Presentan en su composición química ácido salicílico, grasa 35-36 %, importantes cantidades de calcio, hierro y potasio; contiene además cristales globoides de proteínas, isoenzimas, hormonas vegetales, saponinas, triterpenoides pentacíclicos, entre otros.13 De esta planta se ha reportado su actividad contra diversos parásitos intestinales14 y protozoos como Plasmodium berghei;15 así como en el tratamiento de problemas prostáticos.16
Rhoeo spathacea conocida como cordován, no tiene antecedentes de efecto contra parásitos; sin embargo, se ha reportado su actividad antifertilizante.17 Por su parte, de la especie Citrus limetta, comúnmente conocida como limón dulce, no se encontró ningún reporte en la literatura. ]]>
En estos ensayos in vitro, ninguno de los extractos mostró una actividad mayor que la pentamidina, utilizada como droga de referencia. Sin embargo, es necesario considerar que los extractos son una mezcla compleja de varios componentes, donde el principio activo podría estar en un porcentaje minoritario, por lo que su fraccionamiento y la consecuente purificación de los componentes activos sería importante para aumentar su actividad antileishmanial.En la literatura existen reportes de otros extractos de plantas que han sido evaluados y han mostrado actividad antileishmanial, entre los que se encuentran, el extracto de Ocimun gratissimum que mostró una CI50 de 71 mg/mL frente a L. chagasi18 y el extracto de Lepidium peruvianum con una actividad leishmanicida de 82,52 % frente a L. braziliensis empleado a una concentración de 400 mg/mL.19
No obstante, la actividad in vitro no se extrapola linealmente a la situación in vivo, la cual tiene una mayor complejidad, donde van a influir diversos factores. Uno de ellos es la transformación metabólica que sufren los compuestos, los cuales pueden degradarse a moléculas más activas o viceversa, por lo que su actividad farmacológica puede cambiar.
Considerando los resultados obtenidos y al compararlos con los reportados en otros estudios18,19 se sugiere continuar los estudios farmacológicos de los extractos de Cucurbita maxima y Rhoeo spathaceae, así como la evaluación de otras plantas en la búsqueda de nuevos agentes antileishmaniales.
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Recibido: 6 de mayo de 2008.
M. C. Marley García Parra. Departamento de Parasitología. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Autopista Novia del Mediodía Km 6 ½ AP 601, Municipio Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba. Fax: 53-7-2046051 y 53-7-2020633. Correo electrónico: marley@ipk.sld.cu
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