Aislamiento y caracterización de cepas de Adenovirus que colonizan el tracto gastrointestinal de pacientes cubanos seropositivos al VIH
Isolation and characterization of Adenovirus strains that invade the gastrointestinal tract of Cuban HIV-positive patients
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Grehete González MuñozI; Armando Salgado VillavicencioII; Olga Pomier SuárezIII; Ángel Goyenechea HernándezIV; María E. González LópezV; Belsy Acosta HerreraVI; Hermis Rodríguez SanchezVII
I Máster en Virología. Licenciada en Microbiología. Investigadora Auxiliar. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Ciudad de La Habana, Cuba.
II Especialista de I Grado en Medicina General Integral. Sanatorio Santiago de las Vegas. La Habana, Cuba.
III Máster en Infectología. Investigadora Agregada. Profesora Asistente. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
IV Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Titular. Profesor Titular. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
V Máster en Infectología. Investigador Auxiliar. Profesor Asistente. Instituto de Gastroenterología. Ciudad de La Habana, Cuba.
VI Especialista de II Grado en Microbiología. Investigadora Agregada. Instructora. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
VII Máster en Bacteriología-Micología. Licenciada en Bioquímica. IPK. Ciudad de La Habana, Cuba.
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RESUMEN
INTRODUCCIÓN: el tracto gastrointestinal es uno de los sistemas que se afecta con frecuencia en el paciente seropositivo al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), de manera que las alteraciones o enfermedades en este sitio representan una causa importante de morbilidad y mortalidad. El hallazgo de cepas de adenovirus, raramente aisladas en pacientes inmunocompetentes, ha sido asociado en ocasiones a la presencia de diarrea, lo cual refleja la importancia del estudio y la tipificación de estas cepas.
OBJETIVOS: conocer la prevalencia de los Adenovirus en muestras de heces fecales de pacientes infectados con el VIH, con diarrea aguda o crónica, así como la caracterización de los agentes aislados, mediante la implementación de métodos rápidos y confiables.
MÉTODOS: fueron analizadas 167 muestras de heces fecales de individuos seropositivos al VIH y 127 seronegativos como grupo control. La prevalencia fue investigada mediante el aislamiento en cultivo celular, se realizó además la tipificación de las cepas aisladas, mediante técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa y la secuenciación nucleotídica. El análisis estadístico se efectuó mediante la prueba exacta de Fisher contenido en el paquete estadístico Epi Info (Versión 6.04).
RESULTADOS: la prevalencia en los pacientes VIH+ fue de 15 %, mientras que en los VIH- fue de 4 %; la diferencia resultó estadísticamente significativa; 96 % de las cepas aisladas en los pacientes VIH+ correspondieron al subgénero D, asociadas en 62,5 % a cuadros diarreicos y estadios avanzados de la infección por VIH.
CONCLUSIONES: los resultados sugieren la importancia de incluir a los adenovirus y su tipificación en el diagnóstico de rutina de los pacientes VIH+, lo cual sería de interés en el manejo clínico de la infección y aportaría datos claves en la vigilancia y el control de la transmisión de la infección hospitalaria y los análisis epidemiológicos. ]]>
Palabras clave: Adenovirus, subgénero D, inmunocomprometidos, VIH.
ABSTRACT
BACKGROUND: the gastrointestinal tract is one of the most frequently affected systems in HIV-positive patients, therefore, changes or diseases occurring in this site represent an important cause of morbidity and mortality. The finding of adenovirus strains, rarely isolated in immunocompetent patients, has been occasionally associated to diarrheas, which reflects the importance of study and typing of these strains.
OBJECTIVES: to find out the prevalence of Adenovirus in feces samples from HIV patients having chronic or acute diarrheas, as well as the characterization of isolated agents through the application of reliable and quick methods.
METHODS: one hundred and sixty seven fecal samples from HIV-positive patients and 127 from seronegative subjects as the control group were analyzed. Isolation in cell cultures determined the prevalence and molecular biology techniques as the polymerase chain reaction and nucleotide sequencing allowed typing of isolated strains. The statistical analysis was based on the Fisher´s exact test included in Epi Info (6.04) statistical software.
RESULTS: the prevalence in HIV positive patients was 15 % whereas in the HIV-negative was 4 %. The difference was statistically significant; 96 % of isolated strains in HIV positive patients belonged to subgenus D, which are linked in 62.5 % of cases to acute diarrheal condition and advanced stages of HIV infection.
CONCLUSIONS: the results indicated the importance of including adenovirus and their typing in the routine diagnosis of patients positive to HIV, all of which would be useful in the clinical management of infection and would contribute key data on surveillance and control of hospital infection transmission and the epidemiological analysis.
Key words: Adenovirus, subgenus D, immunosuppresed, HIV.
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Los adenovirus humanos (AdVH) constituyen una extensa familia, que incluye 51 serotipos, divididos en 6 subgéneros (del A hasta el F), ellos representan una causa importante de morbilidad y mortalidad, especialmente en los pacientes con transplantes y en los individuos afectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).1,2
Estudios previos han revelado que cualquiera de los subgéneros existentes podrían causar infecciones severas en el paciente inmunocomprometido, pero el papel de serotipos individuales no ha sido esclarecido.1 La implementación de métodos rápidos y confiables que permitan la detección de todos los AdVH, así como la caracterización individual de los serotipos involucrados, resulta una cuestión de relevancia clínica en la aplicación de un tratamiento oportuno en este tipo de pacientes, porque el uso de pruebas serológicas tienen valor limitado por causa del daño que ellos presentan de la respuesta inmune.3
El tracto gastrointestinal (TGI) es uno de los sistemas más afectados en el paciente seropostivo, la diarrea constituye el signo cardinal por su frecuencia y magnitud clínica.4 Esta manifestación puede ser reflejo de una amplia lista de enfermedades infecciosas, dentro de las cuales se encuentran los virus, que en muchos casos es imposible de determinar el agente etiológico, por causa en parte de la no inclusión en los procedimientos diagnósticos rutinarios de pruebas que los detecten. Tal es el caso de los AdVH, cuya importancia potencial y posible papel como infección oportunista en sida, ha sido minimizada en ocasiones.5 ]]>
Sobre la base de estos antecedentes, en este estudio se tuvo como objetivo conocer la prevalencia de los AdVH en muestras de heces fecales de pacientes infectados con el VIH, con diarrea aguda o crónica, así como la caracterización de los agentes aislados.Se estudió un total de 167 muestras de heces fecales de pacientes adultos seropositivos al VIH, recibidas en el Laboratorio Nacional de Referencia de Virus Respiratorios, entre 2004 y 2006, como parte de un estudio de infecciones virales en hospederos inmunocomprometidos, así como 127 muestras de heces de individuos seronegativos al VIH utilizados como grupo control (tabla 1).
Las muestras fueron procesadas e inoculadas por duplicado en 3 líneas celulares: Hela, Hep2 y A549, y fueron observadas hasta la aparición del efecto citopático que osciló entre 7 y 15 d, con 3 pases sucesivos.
La identificación viral se realizó por las técnicas de inmunofluorescencia indirecta (IFI), con el empleo de un anticuerpo monoclonal contra la región del hexón, común a todos los Adv, y por reacción en cadena de la polimerasa (RCP) de tipo genérico, con cebadores que amplifican esta misma región, lo que permitió detectar los 51 serotipos existentes de AdVH.6
Para la caracterización de los aislamientos, se utilizó la metodología siguiente:
· RCP en tiempo real: para el establecimiento de los 6 subgéneros (A-F) de AdVH, que amplifican una región del hexón, específica para cada subgénero.7
· RCP: para la determinación del serotipo en el caso del subgénero C, amplificando una región de la fibra, específica para cada uno de los serotipos de este subgénero.8
]]> · RCP y secuenciación nucleotídica: para la determinación de los serotipos del subgénero D, amplificando una pequeña zona dentro de la región hipervariable del hexón.3
El análisis estadístico se realizó mediante la prueba exacta de Fisher contenida en el paquete estadístico Epi Info (Versión 6.04).
De las 167 muestras de pacientes seropositivos al VIH que fueron investigadas, en 25 de ellas se aislaron adenovirus, que representa 15 % de prevalencia, y la diferencia respecto al grupo control es estadísticamente significativa. Este resultado es coincidente con otros reportes que plantean que la colonización del TGI por AdVH, fundamentalmente del subgénero D, puede ser de hasta 30 %.1,9
Las cepas aisladas en los pacientes seropositivos correspondieron al subgénero D, las cuales no fueron encontradas en ningún caso en los individuos seronegativos, excepto en uno (paciente 10) que resultó ser una coinfección de los serotipos 1 y 5, pertenecientes al subgénero C (tabla 2). Este hallazgo corrobora el hecho de que los pacientes seropositivos son más propensos a adquirir infecciones por Adenovirus de este subgénero, como resultado de su inmunidad debilitada, por causa de respuestas ineficaces de los linfocitos T citotóxicos o por diferencias en la virulencia peculiar de estas cepas.1,5,9 De las 24 cepas aisladas del subgénero D, 15 (62,5 %) provenían de pacientes con diarrea, lo que refuerza la importancia del estudio de los mecanismos por los cuales estas cepas, cuyos serotipos raramente o nunca son aislados en individuos inmunocompetentes, se encuentran colonizando el TGI de los pacientes seropositivos, durante los últimos estadios de la infección y cuyo significado en la patogenia no ha quedado esclarecido al no haberse estudiado con profundidad tales mecanismos.9
Tabla 2. Subgéneros y serotipos de Adenovirus aislados de las heces en pacientes VIH+
| Paciente | ]]> Subgénero | Serotipo | Categoría clínica |
| 1 | D | 17 | VIH |
| 2a,b | D | - | ]]> sida |
| 3b | D | 42 | VIH |
| 4b | D | 42 | sida |
| 5b | ]]> D | 38 | sida |
| 6b | D | 19 | sida |
| 7 | D | 10 | ]]> VIH |
| 8b | D | 13 | sida |
| 9 | D | 13 | VIH |
| 10 | ]]> C | 1 + 5 | VIH |
| 11 | D | 9 | VIH |
| 12b | D | 26 | ]]> sida |
| 13 | D | 29 | sida |
| 14 | D | 38 | VIH |
| 15b | ]]> D | 49 | sida |
| 16 | D | 24 | sida |
| 17b | D | 46 | ]]> sida |
| 18 | D | 17 | sida |
| 19b,c | D | 39 | sida |
| 20b,c | ]]> D | 43 | sida |
| 21b | D | 49 | sida |
| 22a,b | D | - | ]]> sida |
| 23b | D | 49 | sida |
| 24a | D | - | VIH |
| 25a,b | ]]> D | - | sida |
El mayor porcentaje de los aislamientos se logró de pacientes con un estado avanzado de la infección por VIH (68 %), que pone de manifiesto la relación entre el deterioro del sistema inmune y la infección.9
A diferencia del grupo control, donde fueron aisladas cepas del subgénero C, que pueden ser excretadas de manera asintomática por largos períodos por causa de una infección respiratoria anterior, se observó una baja frecuencia de estos serotipos en los pacientes seropositivos debido probablemente a una inmunidad específica adquirida antes de la infección por VIH.10
No pudieron ser serotipadas 4 cepas por los métodos de secuenciación, probablemente, porque la lenta progresión de la enfermedad característica de estos pacientes facilita las mutaciones que ocurren dentro de una cepa y por eventos de recombinación entre serotipos coinfectantes que reflejan la evolución, variedad y difícil tipificación de estas.2,9,10
En conclusión, la colonización por AdVH del TGI por cepas del subgénero D es frecuente en los pacientes infectados con el VIH, especialmente los que presentan cuadros gastrointestinales, y estadios avanzados de la enfermedad. Este es el primer estudio en Cuba donde se logran aislar y serotipar cepas del subgénero D de AdVH y de acuerdo con este, se sugiere la importancia de incluir a los AdVH en el diagnóstico de rutina de los pacientes seropositivos con cuadros gastrointestinales, así como la caracterización de los agentes aislados. El diagnóstico serotipo- específico podría además ser de interés en el contexto del manejo clínico de la enfermedad relacionada con Adv; aportaría datos claves para la vigilancia y el control de la transmisión intrahospitalaria y los análisis epidemiológicos, en cuanto a incidencia y distribución de las infecciones por serotipos individuales.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 8 de julio de 2008. ]]> Aprobado: 25 de agosto de 2008.
Lic. Grehete González Muñoz. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". AP 601. CP 11300. Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: greg@ipk.sld.cu ]]>