Susceptibilidad in vitro frente a fluconazol y voriconazol de cepas de Cryptococcus aisladas en Cuba
In vitro susceptibility of isolated Cryptococcus strains to fluconazole and voriconazole
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María Teresa Illnait ZaragozíI; Jacobus Franciscus Gerardus Marie MeisII; Gerardo Félix Martínez MachínIII; Ilse Curf BreukerIV; Carlos Manuel Fernández AndreuV; Mayda Rosa Perurena LanchaVI
I Máster en Bacteriología-Micología. Investigadora Auxiliar. Profesora Auxiliar. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). La Habana, Cuba.
II Doctor en Ciencias. Hospital Canisius Wihelmina (CWZ), Nijmegen, Países Bajos.
III Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Auxiliar. Profesor Auxiliar. IPK.
IV Licenciada en Microbiología. CWZ. Países Bajos.
V Doctor en Ciencias. Investigador Titular. Profesor Titular. IPK. La Habana, Cuba.
VI Máster en Bacteriología-Micología. Investigador Auxiliar. Profesor Asistente. IPK. La Habana, Cuba.
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INTRODUCCIÓN: las infecciones fúngicas invasoras se han incrementado como consecuencia de los avances de la medicina en el área de la transplantología, el tratamiento del cáncer, las enfermedades autoinmunes y el sida, fundamentalmente. La criptococosis, antes infrecuente, ocupa ahora el tercer lugar en la incidencia de micosis graves en este último grupo de pacientes y constituye además la de mayor letalidad. Hasta el momento existen pocos reportes sobre el desarrollo de resistencia de Cryptococcus a los antifúngicos, pero se prevé que el amplio uso de fluconazol pudiera favorecer la emergencia de cepas menos sensibles.
OBJETIVOS: dada la importancia de mantener la vigilancia de la susceptibilidad a los antifúngicos y de poder evaluar nuevas opciones terapéuticas, se determinó la actividad in vitro del fluconazol y el voriconazol frente a un amplio número de cepas de Cryptococcus aisladas a partir de muestras clínicas y ambientales mediante el método de Etest.
MÉTODOS: se determinó la susceptibilidad in vitro mediante Etest frente a fluconazol y voriconazol de 159 cepas de Cryptococcus (117 obtenidas a partir de muestras clínicas y 42 de fuentes ambientales de la región centro-occidental de Cuba).
RESULTADOS: los aislamientos estudiados mostraron valores bajos de concentraciones mínimas inhibitorias, sobre todo frente a voriconazol. Los rangos, las medias geométricas y las modas fueron de 0,031-128, 4,631 y 3 mg/mL para fluconazol y 0,003-8, 0,02 y 0,016 mg/mL para voriconazol, respectivamente. Aunque de forma general los valores de concentraciones mínimas inhibitorias fueron más elevados en los aislamientos ambientales, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p= 0,05) entre las cepas de acuerdo con el origen (clínica/ambiental) o la procedencia geográfica.
CONCLUSIONES: se señala la importancia de continuar este tipo de estudio para la detección de la aparición de resistencia a las drogas más empleadas en la terapéutica anticriptocósica, así como en la búsqueda de nuevas estrategias para el tratamiento de esta infección.
Palabras clave: Cryptococcus, susceptibilidad in vitro, fluconazol, voriconazol, Etest.
INTRODUCTION: invasive fungal infections have increased as a result of medical advances in the sphere of transplantation, cancer treatment, autoimmune diseases and AIDS fundamentally. Cryptococcus disease, infrequent before, holds the third place in the incidence of severe mycosis in AIDS patients and it is also the most lethal. Up to the present, there exist few reports on the development of Cryptococcus resistance to antifungal products, however, it is foreseen that wide use of fluconazole might encourage the emergence of less susceptible strains.
OBJECTIVES: given the importance of surveillance of antifungal susceptibility and of the evaluation of new therapeutical options, in vitro action of fluconazole and voriconazole on a high number of isolated Cryptococcus strains was determined through Etest method on clinical and environmental samples. ]]>
METHODS: in vitro susceptibility to fluconazole and voriconazole of 159 Cryptococcus strains (117 from clinical samples and 42 from environmental sources of Central and Western regions in Cuba) was determined through Etest method.
RESULTS: the studied isolates showed low MIC values, mainly susceptibility to voriconazole. Ranges, geometric means and modes were 0.031-128, 4.631 y 3 mg/mL for fluconazole and 0.003-8, 0.02 y 0.016 mg/mL for voriconazole, respectively. Although MIC values were generally higher than those of environmental isolates, there were no statistically significant differences (p= 0.05) among strains according to their origin (clinical/environmental) or to their geographical location.
CONCLUSIONS: this paper points out the importance of continuing this type of study for the detection of resistance to the most used drugs in anticryptococcus disease therapy as well as in the search of new strategies to treat this infection.
Key words: Cryptococcus, in vitro susceptibility, fluconazole, voriconazole, Etest.
INTRODUCCIÓN ]]>
Antes de la aparición del sida, la criptococosis se comportaba como una infección poco frecuente.1 Posteriormente, su incidencia se elevó como consecuencia del incremento de la población inmunocomprometida, resultado del aumento de las terapias inmunosupresivas y de la pandemia producida por la infección con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).2 Luego de la introducción de la terapia antirretroviral altamente efectiva (TARVAE), el número de pacientes afectados por esta micosis en el último grupo de personas ha declinado, aunque la tasa de mortalidad por su causa continúa invariable (10 %), con un tiempo de vida medio de 14 d a pesar del tratamiento antifúngico convencional.3 Al menos 2 factores pudieran explicar estos hechos: el incremento de la presión intracraneal y la moderada efectividad del régimen terapéutico que con frecuencia requiere más de 2 semanas para esterilizar el líquido cefalorraquídeo.3,4Hasta el momento, los principales antifúngicos disponibles para el tratamiento de la criptococosis se encuentran limitados a la anfotericina B, la 5 fluocitosina y el fluconazol.3,4 Aunque existen evidencias de que las recaídas de infecciones oportunistas son menos frecuentes cuando los pacientes reciben TARVAE, las guías actuales de tratamiento recomiendan el uso de fluconazol como terapia de mantenimiento en los cuadros meníngeos.3,4
La mayor preocupación con respecto al uso de los azoles, es la posible emergencia de cepas menos sensibles, lo cual ha sido descrito en otros hongos, aislados particularmente en pacientes inmunocomprometidos.2 No obstante, la resistencia de Cryptococcus a estos antifúngicos se ha reportado con menos frecuencia.1-3
Los resultados de trabajos previos realizados en el Laboratorio Nacional de Referencia de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), empleando el método de microdilución en caldo, han demostrado una elevada sensibilidad de las cepas de Cryptococcus estudiadas frente a fluconazol y anfotericina B.5,6 Dada la importancia de mantener la vigilancia de la susceptibilidad a los antifúngicos y de poder evaluar nuevas opciones terapéuticas, se determinó la actividad in vitro del fluconazol y el voriconazol frente a un amplio número de cepas de Cryptococcus, aisladas a partir de muestras clínicas y ambientales mediante el método de Etest.
MÉTODOS
Microorganismos
Se estudiaron 159 cepas de Cryptococcus: 117 fueron aisladas de pacientes con neurocriptococosis (93 de ellos eran seropositivos al VIH) y 42 a partir de excretas de palomas de 3 localizaciones geográficas de Cuba: Ciudad de La Habana (5), Cienfuegos (6) y Pinar del Río (31).
Todos los especímenes fueron identificados en el momento de su aislamiento siguiendo la metodología convencional7 y se conservaron en agua destilada estéril a temperatura ambiente. Estos procedimientos se llevaron a cabo en el laboratorio de micología del IPK. Antes de realizar los estudios de susceptibilidad antifúngica, la identidad de todos los aislamientos fue confirmada mediante el sistema comercial AuxacolorMT2 (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, Francia). ]]>
Determinación de la susceptibilidad antifúngica
Se emplearon tiras de Etest de fluconazol y voriconazol (AB BIODISK; Solna, Suecia). Las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) fueron determinadas siguiendo la metodología de Pfaller y otros. Se estimó como CMI el valor más bajo de concentración donde el borde de la elipse de inhibición interceptó la escala de la tira.8
Como controles fueron utilizadas las cepas Candida krusei ATCC 6258 y C. parapsilosis ATCC 22019.
Análisis estadístico
Se determinaron los intervalos, las modas y las medias geométricas (MG) de los valores de CMI obtenidos. La CMI50 y la CMI90 fueron definidas como las menores concentraciones de la droga que inhibieron a 50 y 90 % de las cepas, respectivamente, y fueron calculadas a partir de los porcentajes acumulativos del número de cepas inhibidas a las diferentes concentraciones de cada antifúngico. Para el análisis de los resultados se empleó el programa GraphPad versión 3.00 para Windows (GraphPAd Sofwar, San Diego, California, EUA). La significación estadística fue definida para p³ 0,05.
RESULTADOS ]]>
Del total de cepas, 157 (98,74 %) fueron identificadas como C. neoformans var. grubii y 2 de los aislamientos a partir de muestras ambientales de Pinar del Río resultaron C. albidus y C. albidisimilus (0,63 % en cada caso).Los valores de CMI de las cepas controles se comportaron dentro de los rangos reportados por el CLSI y los aislamientos estudiados mostraron patrones uniformes de susceptibilidad frente a los antifúngicos probados.
En la tabla se muestran los datos de susceptibilidad antifúngica obtenidos. De forma general, se encontró que las cepas estudiadas fueron más sensibles al voriconazol. Las CMI variaron de 0,031 a 128 mg/mL y de 0,003 a 8 mg/mL para el fluconazol y el voriconazol, respectivamente. Los valores más elevados correspondieron a los aislamientos de origen clínico, los cuales mostraron cifras de CMI50, CMI90 y media geométrica superiores respecto a las de origen ambiental. Entre estas últimas, las procedentes de Ciudad de La Habana mostraron ser menos susceptibles frente a estas drogas; no obstante, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas (p£ 0,05).
DISCUSIÓN
Debido al incremento de las infecciones fúngicas sistémicas, los reportes cada vez más frecuentes de fallo terapéutico durante el tratamiento con azoles y el desarrollo creciente del número de agentes antifúngicos, han traído como consecuencia que la ayuda del laboratorio de microbiología para guiar la selección de la terapia antimicótica haya ganado mayor atención.9-12
A pesar de la experiencia acumulada y la aparición de nuevas preparaciones antifúngicas, el tratamiento de la infección por Cryptococcus está aún por resolverse. La alta incidencia de mortalidad y de recaídas indica la necesidad de nuevas estrategias terapéuticas. No obstante, existen escasos estudios de correlación entre los resultados de la susceptibilidad antifúngica in vitro y la respuesta clínica al tratamiento anticriptocósico.12,13
El método de microdilución en caldo recomendado por el CLSI permanece como método de referencia, no obstante, su incorporación a la rutina del laboratorio ha sido difícil y se han desarrollado otros métodos alternativos durante los últimos años.12 Maxwell y otros, así como Aller y otros sugieren que la prueba de Etest pudiera ser una alternativa útil, por resultar de más fácil realización y sus resultados son tan confiables como los de las pruebas de microdilución en caldo.12,13
El amplio uso del fluconazol, especialmente en los pacientes VIH positivos, pudiera generar una presión selectiva en el surgimiento de cepas menos sensibles a este antifúngico, sin embargo, hasta el momento los mecanismos de resistencia de Cryptococcus a los azoles no han sido claramente definidos y solo se ha reportado un escaso número de cepas de esta levadura resistente a estos.11,14-16 Los resultados de este trabajo no evidencian diferencias significativas entre los aislamientos a partir de pacientes con sida respecto al resto. ]]>
De las drogas estudiadas, el fluconazol mostró la menor actividad, que coincide con lo publicado internacionalmente.1,2,7 Reportes previos han demostrado la baja acción de este antimicótico in vitro frente a C. neoformans, por lo que los buenos resultados terapéuticos obtenidos han sido ampliamente atribuibles a la alta concentración que es capaz de alcanzar en el LCR.9,10Afortunadamente el arsenal antifúngico se ha incrementado en las 2 últimas décadas. El voriconazol es un nuevo triazol con actividad frente a aislamientos de Candida, incluidos aquellos con resistencia in vitro al fluconazol.12,15 La favorable farmacocinética del voricozanol pudiera explicar los mejores resultados observados en ratas infectadas que han sido tratadas con esta droga, en comparación con aquellas que han recibido itraconazol. No obstante, su actividad frente a C. neoformans no ha sido suficientemente estudiada.15,16
Estos resultados concuerdan con aquellos informados por Bava y Negroni,16 Fromtling y otros17 así como Franzot y otros,18 que no encontraron diferencia significativa en la susceptibilidad in vitro de los aislamientos ambientales y clínicos de Cryptococcus obtenidos en Argentina, Puerto Rico y Brasil, respectivamente.
En conclusión, los resultados aquí presentados sugieren que a pesar del amplio uso del fluconazol como terapia de mantenimiento en las personas con sida, la mayoría de las cepas de Cryptococcus estudiadas parecen ser susceptibles in vitro a esta droga. Por otra parte, los bajos valores de CMI encontrados frente al voriconazol demuestran que este es más activo que el fluconazol. No obstante, estos alentadores resultados necesitan ser confirmados mediante ensayos clínicos para dilucidar el papel de este nuevo antifúngico en el tratamiento de la infección criptocósica. Hoy día, cuando Cryptococcus ha emergido como un importante patógeno oportunista, los estudios de susceptibilidad in vitro constituyen una herramienta de gran utilidad en la determinación de la conducta terapéutica a seguir, con vistas a mejorar la calidad de vida de las personas afectadas por esta micosis.
AGRADECIMIENTOS
A la Sociedad Internacional de Micología Humana y Animal (ISHAM, de sus siglas en inglés) así como al Hospital Canisius-Wilhelmina de Nijmegen, Países Bajos, los cuales financiaron este estudio.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Recibido: 4 de abril de 2008.
Aprobado: 20 de mayo de 2008.
Dra. María Teresa Illnait. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Autopista Novia del Mediodía Km 6½. Lisa. AP 601 Playa. Ciudad de La Habana, Cuba. Correo electrónico: mtillnait@infomed.sld.cu ]]>
