Análisis genotípico de aislamientos de Mycobacterium tuberculosis en La Habana en 2009
Genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolates in Havana, 2009
MSc. Roxana Gozá Valdés, Dr. Raúl Díaz Rodríguez
Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias (LNRITM). Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). La Habana, Cuba.
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RESUMEN
Introducción: la búsqueda de alternativas al polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP, siglas en inglés) con la sonda IS 6110 en la genotipificación de Mycobacterium tuberculosis ha propiciado el desarrollo de la tipificación con número variable de repeticiones en tándem de unidades repetitivas interespaciadas de micobacterias (MIRU-VNTR, siglas en inglés).
Objetivo: evaluar la diseminación de genotipos de M. tuberculosis en La Habana en 2009.
Métodos: se estudiaron 80 aislamientos procedentes de unidades de salud durante 2009 y se caracterizaron por tipificación MIRU-VNTR-15. Los genotipos se expresaron como códigos numéricos según el número de copias de cada MIRU-VNTR amplificado, y se analizaron con la herramienta bioinformática "en línea" MIRU-VNTR plus. Se utilizó MIRU-VNTR-24 como tipificación secundaria en los aislamientos agrupados por MIRU-VNTR-15.
Resultados: con MIRU-VNTR-15 se definieron 41 genotipos diferentes; entre ellos, 33 únicos (41,25 %), y ocho que agruparon a 47 aislamientos (58,75 %). La tipificación MIRU-VNTR-24 logró diferenciar sólo el 5 % de éstos, disminuyendo el porcentaje de agrupamiento a 53,75 %.
Conclusiones: el elevado agrupamiento encontrado sugirió transmisión reciente, lo que pudo tener influencia en la incidencia de tuberculosis en La Habana en 2009.
ABSTRACT
Introduction: the search for alternatives to restriction fragment length polymorphism (RFLP) with the IS6110 probe for the genotyping of Mycobacterium tuberculosis has paved the way for the development of mycobacterial interspersed repetitive-unit-variable-number tandem-repeat typing (MIRU-VNTR).
Objective: evaluate the spread of M. tuberculosis genotypes in Havana in 2009. ]]>
Key words: Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, genotyping, MIRU-VNTR, molecular typing, genetic characterization, Havana.
INTRODUCCIÓN
En los inicios del nuevo milenio, la tuberculosis (TB) se considera la enfermedad infecciosa humana más importante, debido a sus altas cifras de morbimortalidad a nivel mundial.
Los métodos de genotipificación de aislamientos clínicos de Mycobacterium tuberculosis han demostrado tener una gran utilidad en el control de la tuberculosis. Desde el punto de vista clínico, la aplicación de la genotipificación permite la detección o exclusión de errores de laboratorio y el seguimiento de casos de recaída para identificar las fallas en el tratamiento, reactivaciones endógenas, y reinfecciones (exógenas). Por otra parte, desde un enfoque de salud pública, la genotipificación facilita la detección de brotes no sospechados y la identificación de cadenas de transmisión y casos secundarios de infección.1
El análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción con la secuencia de inserción IS6110, (RFLP-IS6110, siglas en inglés), ha sido el método de tipificación más aplicado como método de referencia en la epidemiología molecular desde 1993.2 No obstante, las limitantes del RFLP-IS6110 han propiciado el desarrollo de nuevas herramientas como: la genotipificación con número variable de repeticiones en tándem de unidades repetitivas interespaciadas de micobacterias (MIRU-VNTR, siglas en inglés). La tipificación por MIRU-VNTR, basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, siglas en inglés), compara la variación de la talla de varios MIRU-VNTR localizados en diferentes lugares del genoma como marcadores genéticos. La última versión de ésta técnica emplea 24 loci MIRU-VNTR, incluyendo 15 loci altamente discriminatorios utilizados fundamentalmente, para estudios epidemiológicos de rutina. El poder resolutivo de la tipificación MIRU-VNTR-24 es igual o superior (en muchos casos, según la zona geográfica) al del RFLP-IS 6110 y se recomienda como herramienta epidemiológica de muy alta resolución y para estudios filogenéticos. Esta variante está propuesta como nueva técnica de referencia para la caracterización genética de M. tuberculosis.2
]]> En Cuba, se implementó la tipificación molecular para aislamientos de M. tuberculosis en la década de los 90. El último estudio genético-poblacional realizado en La Habana, Cuba (1998), determinó por RFLP-IS6110 un porcentaje elevado (45 %) de agrupamiento de aislamientos de M. tuberculosis (indicativo de alta transmisión reciente de la enfermedad).3 Por otra parte, la tipificación MIRU-VNTR-15 loci se implementó en 2009 para caracterizar 12 aislamientos de M. tuberculosis multidrogorresistentes (MDR).4 Sin embargo, desde hace más de una década no se tienen datos de la dinámica de transmisión de la enfermedad en Cuba. En el presente trabajo se utilizó las tipificaciones MIRU-VNTR-15 y MIRU-VNTR-24 (como herramienta secundaria) para evaluar la diseminación de genotipos de M. tuberculosis en La Habana en 2009.
MÉTODOS
De enero a diciembre de 2009, en el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias (LNRITM) del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK) se estudiaron 80 aislamientos de M. tuberculosis de muestras de esputo de 80 pacientes procedentes de unidades de salud de La Habana. La tipificación MIRU-VNTR-15 se efectuó según Supply et al., 2006.2 Se utilizaron pares de oligonucleótidos correspondientes a las regiones flanqueantes de los 15 loci MIRU 4, MIRU 10, MIRU 16, MIRU 31, MIRU 26, MIRU 40, VNTR 424, VNTR 577, VNTR 1955, VNTR 2163b, VNTR 2165, VNTR 2401, VNTR 3690, VNTR 4052 y VNTR 4156; los cuales se amplificaron y analizaron individualmente. En la PCR (volumen final de 20 µL) se empleó el sistema de amplificación HotStar de Qiagen (Hilden, Alemania), con un termociclador Alpha SC (Analytik Jena AG, Jena, Alemania) bajo las siguientes condiciones: 15 min a 95 ºC, 40 ciclos de 1 min a 94 ºC, 1 min a 59 ºC y 1,5 min a 72 ºC, y una extensión final de 10 min a 72 ºC. Las ampliaciones se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 2 %. El número de copias de cada locus para cada aislamiento se estimó según la talla del producto amplificado, empleando los marcadores 50 y 100 pb DNA ladder (Promega, Madison, WI, EE.UU.).5
Los genotipos MIRU-VNTR 15 loci se definieron como códigos numéricos de 15 dígitos, donde cada dígito representa el número de copias repetidas en tándem. Se definió como agrupamiento cuando dos o más aislamientos tuvieron genotipos idénticos (15 dígitos iguales).6 Para confirmar los agrupamientos definidos por MIRU-VNTR-15, se utilizó MIRU-VNTR-24 como tipificación secundaria, amplificando nueve loci adicionales MIRU 2, MIRU 20, MIRU 23, MIRU 24, MIRU 27, MIRU 39, VNTR 2347, VNTR 2461 y VNTR 3171. Los genotipos obtenidos (15 o 24 dígitos) se analizaron con la herramienta bioinformática "en línea" MIRU-VNTR plus (http://www.miru-vntrplus.org) 7 Tomando en cuenta los valores del polimorfismo genético de cada locus o de diversidad alélica (h), se definieron los loci altamente (h> 0,6), moderadamente (0,3≤ h≤0,6) y pobremente discriminatorios (h< 0,3), según Sola et al., 2003.8 El poder discriminatorio de las técnicas de tipificación se determinó mediante el cálculo del índice discriminatorio de Hunter y Gaston, 1988 (HGDI)9 y el índice de agrupamiento según lo descrito por Small et al., 1994.10
RESULTADOS
La aplicación de los métodos de tipificación MIRU-VNTR-15 y MIRU-VNTR-24 a los 80 aislamientos, dio los resultados que se muestran en la Tabla. Como se puede observar, con la aplicación de MIRU-VNTR-24 el porcentaje de aislamientos en agrupamientos disminuyó a 53,75 % (43/80). Se obtuvo la misma cantidad de agrupamientos, y sólo se diferenciaron seis aislamientos de los 47 agrupados por el método MIRU-VNTR-15.
En cuanto a la distribución de los 80 aislamientos por agrupamientos según MIRU-VNTR-15 y MIRU-VNTR-24, en la figura se puede apreciar que del agrupamiento (C1) se separaron 2 aislamientos conformando uno nuevo (C1a), se diferenciaron 2 aislamientos del agrupamiento (C2) como genotipos únicos, y el agrupamiento (C5) se desintegró; resultando en la obtención de mayor cantidad de genotipos diferentes (45), así como de genotipos únicos (37) (Tabla 1).
]]> En esta tabla además se puede observar que el índice de agrupamiento (rango de transmisión reciente) obtenido con MIRU-VNTR-24 fue inferior. En relación al poder discriminatorio de ambas técnicas, se obtuvo un valor de HGDI superior (0,9257) para MIRU-VNTR-24. La diversidad alélica (h) de los 15 loci MIRU-VNTR osciló entre 0,21 y 0,7. Se encontraron seis loci altamente discriminatorios (h> 0,6): VNTR 1955, VNTR 2163b, VNTR 4052, MIRU 10, MIRU 40 y MIRU 31; ocho loci moderadamente discriminatorios (0,3≤ h≤0,6): VNTR 0424, VNTR 0577, VNTR 2165, VNTR 2401, VNTR 3690, VNTR 4156, MIRU 04, MIRU 26 y sólo resultó pobremente discriminatorio (h<0,3) el locus MIRU 16. De los nueve loci adicionales incorporados en la tipificación MIRU-VNTR-24, ninguno resultó altamente discriminatorio, dos loci MIRU 02, MIRU 39 moderadamente discriminatorios y siete resultaron pobremente discriminatorios.La tipificación MIRU-VNTR-24 tuvo una eficiencia discriminatoria superior por agrupar menos cantidad de aislamientos y tener un valor de HGDI superior. Los nueve loci MIRU-VNTR adicionados en este formato resultaron tan poco discriminatorios que el incremento en un 5 % en la resolución no fue estadísticamente significativo (p= 0,523). Existió concordancia en cuanto a la identificación de genotipos por ambas técnicas en el 95 % (76/80) de los aislamientos. Se encontró concordancia completa o alta con datos MIRU-VNTR-24 en todos los agrupamientos definidos por MIRU-VNTR-15.
DISCUSIÓN
La búsqueda de una técnica molecular alternativa al RFLP, propició el desarrollo de la tipificación por MIRU-VNTR. Supply et al. , 2006 publicaron un protocolo con 24 loci MIRU-VNTR (12 MIRU, 12 VNTR), considerando que un subgrupo de 15 loci (MIRU-VNTR-15) tenía una alta eficiencia para estudios epidemiológicos (96 % de la resolución obtenida con los 24 loci).2 Se ha reportado una mejor discriminación con la tipificación MIRU-VNTR-15 (o MIRU-VNTR-24) comparado con RFLP-IS6110 en aislamientos con número bajo de copias de IS6110 (<6 bandas).7,11
La epidemiología molecular considera que aislamientos con genotipos idénticos conforman agrupamientos genéticos y los pacientes involucrados son fuertes candidatos a pertenecer a una misma cadena de transmisión, lo que implicaría una infección reciente. Por otra parte, los aislamientos con genotipos únicos están más relacionados con reactivaciones de infecciones latentes.12 Por tanto, el agrupamiento de aislamientos indistinguibles por tipificación molecular, se ha usado para inferir rangos de transmisión reciente de la enfermedad en una población definida.7,10
En este trabajo, el porcentaje de aislamientos en agrupamientos obtenido (58,75 %) con la tipificación MIRU-VNTR-15 se considera alto, teniendo en cuenta que Cuba se encuentra entre los países de baja prevalencia de TB. Por ejemplo, en 2009, se registró una tasa de incidencia de 5,9 casos por cada cien mil habitantes, una de las más bajas en la región de las Américas y el Caribe.13 Además, Cuba se caracteriza por una inmigración baja desde países en los que existe incidencia alta de TB y circulación elevada de aislamientos MDR, así como por una baja carga de VIH; factores fundamentales en la diseminación de la enfermedad y en la coinfección TB-VIH a escala mundial. Inesperadamente, el valor de agrupamiento de nuestro trabajo superó el de otros estudios, como el de Alonso et al., 2009 6 (43,1 %), con el mismo método y mayor cantidad de aislamientos (343) en un período de tres años en Almería, una provincia de España donde se registra la mayor incidencia de TB del país y hay alto índice de inmigración. También superó a lo encontrado por Godreuil et al., 2007 14 (53,3 %) en Burkina Faso, otra zona de alta incidencia de TB, en un estudio de un año con 120 aislamientos. En cambio, el agrupamiento encontrado en La Habana resultó similar a diferentes trabajos de autores españoles que obtuvieron más de 50 % de casos agrupados.15, 16 Sin embargo, fue inferior al valor publicado (73 %) por Maes et al., 2008 17 en un estudio aplicando la tipificación MIRU-VNTR-24 a 41 aislamientos en un período de un año en Warao, una zona de población indígena de Venezuela donde existe alta incidencia de TB. En cuanto al rango de agrupamiento (transmisión reciente) obtenido con MIRU-VNTR-15 (48,75 %) en esta investigación también resultó alto. Un valor similar (45 %) se obtuvo en el último estudio genético poblacional (1998) realizado en La Habana con la técnica RFLP-IS6110;3 pero en este último caso ese alto porcentaje de agrupamiento estuvo aparejado a un incremento de la incidencia de TB en ese período. Este hallazgo alertó sobre la necesidad de reevaluar las estrategias de acción y funcionamiento del programa de control de TB a nivel nacional; y sugirió, al igual que otros estudios en regiones de baja incidencia, que la transmisión reciente era mucho mayor que lo clásicamente supuesto (10 %) por métodos epidemiológicos convencionales en años anteriores.10
Por otro lado, también fue similar a lo registrado en algunas zonas de alta incidencia de TB, como Guayana Francesa (49,3 %),18 región con alta inmigración desde países con elevada incidencia de TB y carga de SIDA; así como a valores de aproximadamente 50 % obtenidos en Zimbabwe19 y Sudáfrica.20
No obstante, por considerarse alto el porcentaje de transmisión reciente obtenido con MIRU-VNTR-15 en La Habana en este trabajo, y ser esto contradictorio con lo esperado en regiones de baja incidencia de TB (30-40 %),21 y con un funcionamiento adecuado de sus programas de control (como Cuba); se decidió utilizar la técnica MIRU-VNTR-24 como herramienta de tipificación secundaria de alta resolución (amplificando 9 loci adicionales) en los aislamientos agrupados por MIRU-VNTR-15, y aumentar así la calidad en la asignación de los agrupamientos.
Con la aplicación de la variante MIRU-VNTR-24, el porcentaje e índice de agrupamiento disminuyeron a 53,75 % y 0,4375, respectivamente. No obstante, esta cifra (53,75 %) superó valores de agrupamiento obtenidos en otras regiones de baja incidencia de TB como Irlanda (28,6 %) 22 y Bélgica (21,6 %);7 así como los de países como Martinica (16,9 %) y Guadalupe (27,2 %).18 Aunque no se pudieron correlacionar los resultados de la tipificación molecular con los datos epidemiológicos de los casos relacionados (datos incompletos), se piensa que este alto porcentaje de agrupamiento podría sugerir que parte de los casos incidentes de TB en La Habana en 2009 se debiera a transmisión reciente de la tuberculosis, con gran número de aislamientos incluidos en los dos agrupamientos más grandes, según MIRU-VNTR-24. Sin embargo, el porcentaje de agrupamiento podría estar sobrestimado. Según resultados obtenidos en los últimos meses con la técnica de genotipificación Spoligotyping en el LNRITM, una cuarta parte de los aislamientos analizados en este trabajo pertenecen al genotipo de la familia de Beijing.23
]]> En estudios recientes,24, 25 otros autores reportan poca discriminación en aislamientos de esta familia con la tipificación MIRU-VNTR-24, sugiriendo el uso de tres regiones VNTR hipervariables adicionales. Los valores de diversidad alélica obtenidos para cada locus presentaron mayor concordancia con los resultados obtenidos por Alonso et al., 2008 en España,11 con Ojo et al., 2010 en Irlanda, 22 y con González, 2009 en un estudio muy puntual realizado en Cuba con MIRU-VNTR-15 aplicado a sólo 12 aislamientos MDR de M. tuberculosis.4 El poder discriminatorio de ambas técnicas resultó más bajo que lo reportado por otros autores, como: Maes et al., 2008 (HGDI=0,95) con MIRU-VNTR-24,17 Ojo et al., 2010 (HGDI=0,9938) con MIRU-VNTR-24,22 Joseph et al., 2013 (HGDI=0,9735) con MIRU-12, 26 y Huyen et al., 2013 (HGDI=0,994) con MIRU-VNTR-24.27El incremento en la resolución del método MIRU-VNTR 24 no resultó significativo, lo cual coincide con los criterios de Supply et al., 2006 que plantean que la selección de los nueves loci adicionales pueden ser de valiosa utilidad en estudios filogenéticos, pero poco útiles en estudios epidemiológicos en determinadas zonas geográficas.2 La adecuada concordancia de genotipos determinada por cada técnica sugiere que MIRU-VNTR-24 es capaz de detectar algunos casos agrupados falsamente por MIRU-VNTR-15, aunque estos comparten una elevada similitud con los otros integrantes del agrupamiento. Los resultados moleculares del presente estudio dan una primera aproximación de la diseminación de genotipos de M. tuberculosis en La Habana en el comienzo del siglo XXI y sientan las bases para diseñar estudios de epidemiología molecular en Cuba. Estos hallazgos podrían tener un mayor alcance científico y práctico si se pudieran combinar con una sólida investigación epidemiológica de los casos involucrados, que permitiría conocer con gran precisión la dinámica de transmisión de la tuberculosis en La Habana y ayudar a sugerir medidas diferenciadas y eficaces para mejorar el control de la enfermedad y avanzar hacia la eliminación de la tuberculosis como problema de salud pública.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos la ayuda técnica y recolección de datos de Dihadenys Lemus, Miguel Echemendía y María Rosarys Martínez.
Este trabajo recibió apoyo de los proyectos "Fortalecimiento del programa nacional de tuberculosis en la República de Cuba", del Fondo Mundial de lucha contra el SIDA, la tuberculosis y la malaria (CUB-708-G03-T), y "Desarrollo de métodos de inmunodiagnóstico, detección de resistencia, caracterización molecular e implementación de sistemas de vigilancia epidemiológica para el control de la tuberculosis", del Convenio Integral de Cooperación Cuba-Venezuela.
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Recibido: 28 de octubre de 2013.
Aprobado: 17 de enero de 2014.
Dra. Roxana Gozá Valdés. Departamento de Bacteriología-Micología. Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones en Tuberculosis y Micobacterias (LNRITM). Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK). Autopista Novia del Mediodía Km 6 1/2, Lisa, La Habana, Cuba.
Tel: 255-3523. Correo electrónico: roxanagoza@infomed.sld.cu