COMUNICACIÓN BREVE
Evaluación in vitro de extractos de invertebrados marinos frente a Leishmania amazonensis
In vitro evaluation of marine invertebrates extracts against Leishmania amazonensis
Lic. Abel Piñón Tápanes, MSc Marley García Parra, MSc Judith Mendiola Martínez, Lic. Aneisy Pérez Hernández, DrC. Lianet Monzote Fidalgo
]]> Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. La Habana, Cuba.
RESUMEN
La leishmaniasis es una parasitosis causada por protozoos del género Leishmania, la cual es endémica en 98 países donde incide con alrededor de 2 millones de nuevos casos por año. Los fármacos utilizados en su tratamiento, presentan numerosos efectos tóxicos, elevado costo y un largo período de aplicación, se añade también la emergencia de la resistencia a los mismos. La medicina natural y el empleo de los recursos naturales se utilizan como alternativas a la terapia actual. El objetivo del trabajo, evaluar la actividad antileishmanial de 15 extractos de invertebrados marinos. Para ello, se determinó la inhibición del crecimiento causada por los extractos frente a promastigotes y amastigotes de Leishmania amazonensis, así como su citotoxicidad frente a macrófagos peritoneales de ratón BALB/c. De los productos evaluados solo 4 (26,7 %) causaron inhibición del crecimiento de los parásitos, mientras que solo el extracto de Echinometra lucunter mostró selectividad (IS = 5) y actividad frente a amastigotes intracelulares (CI50 de 28,1 ± 6,0 µg/mL). Estos resultados promisorios brindan conocimientos acerca de la posibilidad de utilizar el extracto de E. lucunter como agente anti-leishmanial.
Palabras clave: invertebrados marinos, leishmaniasis, enfermedades tropicales.
ABSTRACT
Leishmaniasis is a parasitosis caused by protozoa of the genus Leishmania. It is endemic in 98 countries, where the disease incidence is about two million new cases per year. The drugs used in the disease’s treatment have numerous toxic effects, high cost and a long application period; besides, the emergence of resistance to them is also added. Natural medicine and the use of natural resources are used as alternatives to current therapy. The study aims to evaluate the antileishmanial activity of 15 marine invertebrates extracts. For this, growth inhibition caused by the extracts against Leishmania amazonensis promastigotes and amastigotes was determined, together with its cytotoxicity against BALB/c mice peritoneal macrophages. Among the evaluated products, only four (26.7%) caused parasite growth inhibition, while only the Echinometra lucunter extract showed selectivity (SR=5) and activity against intracellular amastigotes (CI50=28.1±6.0 mg/ml). These promising results provide insights about the possibility of using Echinometra lucunter extract as an antileishmanial agent.
Keywords: marine invertebrates, leishmaniasis, tropical diseases.
INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis forma parte del grupo de enfermedades tropicales que afecta un gran número de personas (con alrededor de 350 millones en riesgo). Tiene una incidencia de 2 millones de nuevos casos reportados por año, en 98 países donde es endémica.1 La terapia actual involucra fármacos con diversas limitantes como: elevada toxicidad, administración parenteral, largo período de aplicación, alto costo y la generación de mecanismos de resistencia a los mismos.2 Debido a estos aspectos, es esencial el descubrimiento de nuevos compuestos con propiedades anti-leishmanial para el desarrollo de alternativas a la terapia vigente.3 Entre las diversas estrategias utilizadas en la actualidad se ha promovido y respaldado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) el uso de la medicina natural y tradicional, en especial en aquellos lugares donde los servicios de salud apropiados son inaccesibles.4
Durante muchos años el ambiente marino ha sido reconocido como una de las mayores fuentes de biodiversidad de todo el mundo. Los organismos marinos sobreviven en su complejo hábitat gracias a sus capacidades metabólicas y fisiológicas, la cual posibilita también la producción de numerosos metabolitos secundarios que no se encuentran en los organismos adaptados al medio terrestre.5-10 Reciente, especial énfasis ha sido dirigido a la búsqueda de nuevos compuestos químicos debido a su actividad biológica, son cada vez más utilizado en las diferentes ramas de la ciencia como en bioquímica, biología, ecología, química orgánica y farmacología.5,11,12 Numerosos compuestos marinos han sido descritos en la literatura, demuestra su valor biológico como antibiótico, anti-fúngico, neurotóxico, anti-viral, anti-inflamatorio, anti-tumoral y anti-microbiano.6,10 En particular, en las últimas décadas se evidenció un continuo desarrollo e incremento de fármacos derivados de organismos procedentes del medio marino frente a diversos protozoos.7 Entre estos podemos mencionar los invertebrados, compuesto por especies de más de 30 familias y 40 géneros.13 En este trabajo, se evalúa la actividad de 15 extractos de invertebrados marinos en modelos in vitro frente a Leishmania amazonensis.
Parásitos
Se utilizó la cepa MHOM/77//LTB0016 de L. amazonensis, donada por el Departamento de Inmunología de la Fundación Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil. Los parásitos se mantuvieron en medio Schneider (SIGMA, St. Louis, MO, EUA), suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 µg/mL) y 10 % de suero fetal bovino (SIGMA, St. Louis, MO, USA) inactivado con calor (56 °C, 30 min).
Organismos
Todos los organismos utilizados pertenecen al grupo de los invertebrados marinos. En la tabla 1 se muestran las especies utilizadas, nombre de la familia, tipo de extracto, lugar de colecta, parte del cuerpo utilizada y número de espécimen. Los organismos evaluados fueron colectados en la costa Norte de zonas de La Habana y Pinar del Río y un ejemplar de cada uno fue depositado en la colección del Acuario Nacional de Cuba.
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Tabla 1. Especies de invertebrados marinos evaluados frente a Leishmania amazonensis
| Especie | Familia | Extracto | Parte utilizada | Zona de colecta | Fecha de colecta | Nº de espécimen a |
| ]]> Bartholomea annulata Lesueur, 1817 | Apitasiidae | hidroalcohólico | cuerpo | Litoral Acuario Nacional | Febrero, 2012 | IDO 03.3.2.010 |
| Cassiopea xamachana Bigelow, 1892 | Rhizostomae | ]]> hidroalcohólico | cuerpo | Santa Fe, La Habana | Septiembre, 2011 | ANC 03.2.001 |
| Echinometra lucunter Linnaeus, 1758 | Echinometridae | hidroalcohólico | parte interna | Litoral Acuario Nacional | ]]> Septiembre, 2011 | IDO 10.3.072 |
| hidroalcohólico | cuerpo | Litoral Acuario Nacional | Septiembre, 2011 | IDO 10.3.072 | ||
| Hermodice carunculata Pallas, 1766 | Amphinimidae | ]]> hidroalcohólico | cuerpo | Litoral Acuario Nacional | Febrero, 2012 | ANC 0039 |
| Holothuria mexicana Ludwid Diels, 1875 | Holothuriidae | hidroalcohólico | cuerpo | Puerto Esperanza, Pinar del Río | ]]> Abril, 2006 | IDO 10.4.011 |
| Lissodendoryx isodictyalis Carter, 1882 | Coelosphaeridae | hidroalcohólico | cuerpo | Costa Norte de La Habana y Pinar del Río | Abril, 2006 | IDO 02.0043 |
| Lytechinus variegatus Lamarck, 1816 | ]]> Toxopneustidae | hidroalcohólico | cuerpo | Costa Norte de La Habana y Pinar del Río | Abril, 2006 | IDO 10.3.013 |
| Molgula occidentalis Traustedt, 1883 | Molgulidae | hidroalcohólico | cuerpo y túnica | ]]> Costa Norte de La Habana y Pinar del Río | Abril, 2006 | IDO 11.1.008 |
| Phallusia nigra Savigny, 1816 | Ascidiidae | hidroalcohólico | cuerpo y túnica | Costa Norte de La Habana y Pinar del Río | Abril, 2006 | IDO 11.1.013 |
| ]]> Protopalythoa variabilis Duerden, 1898 | Sphenopidae | hidroalcohólico | cuerpo | Litoral Acuario Nacional | Febrero, 2012 | ANC 03.3.5.005 |
| Sabellastarte magnifica Shaw, 1880 | Sabellidae | hidroalcohólico | ]]> cuerpo | Litoral Acuario Nacional | Febrero, 2012 | IDO 05.1.0124 |
| Stichodactyla helianthus Ellis, 1768 | Stichodactylidae | acuoso | completo | Costa Norte de La Habana | Febrero, 2012 | ]]> IDO 03.3.2.006 |
a : ANC (Acuario Nacional de Cuba), IDO (Instituto de Oceanología).
Preparación de los extractos
Se prepararon un total de 15 extractos a partir de 13 especies de invertebrados marinos según se describe en la tabla 1. Las muestras de cada organismo se maceraron con agitación ocasional durante una semana, se utilizó etanol al 80 %. De los organismos Holothuria mexicana, Lissodendoryx isodictyalis, Lytechinus variegatus y Phallusia nigra; se llevó a cabo un proceso de autolisis con agua destilada y regímenes intermitentes de homogenización mecánica con Waring-Blender durante 2 min en etanol al 80 %. Las suspensiones se mantuvieron en maceración a 4 ºC durante 72 h con agitación ocasional. Estas se centrifugaron a 10 000 g y se colectó el sobrenadante. Todos los extractos fueron liofilizados y almacenados a -20 °C. Una muestra fue disuelta a 20 mg/mL en dimetilsulfóxido y almacenada a 4 ºC para realizar las evaluaciones biológicas.
Fármaco de referencia
Se empleó la pentamidina (Richet, Buenos Aires, Argentina) a una concentración de 10 mg/mL, fármaco de uso clínico en el tratamiento de la leishmaniasis.
Actividad frente a promastigotes
Los extractos se adicionaron en concentraciones de 12,5 a 200 µg/mL a cultivos de promastigotes que se ajustaron a 105 parásitos/mL. A continuación, se incubaron durante 72 h a 26 °C. La actividad se determinó mediante un método colorimétrico con el uso de una solución de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2,5-difeniltetrazolio) (MTT, SIGMA, St. Louis, MO, USA). Los resultados se expresaron como concentración inhibitoria media (CI50). Los extractos que mostraron una CI50 menor que 100 µg/mL fueron seleccionados para realizar el estudio de citotoxicidad.
Citotoxicidad
]]> Para evaluar la toxicidad se extrajeron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c mediante lavados con RPMI (SIGMA, St. Louis, MO, USA) suplementado con antibióticos (penicilina sódica 200 UI, estreptomicina 200 mg/mL). Se sembraron a una concentración de 3 x 10 5 células/mL y se trataron con los extractos a concentraciones desde 12,5 hasta 200 µg/mL, durante 72 h a 5 % de CO2 y 37 ºC. La actividad se determinó mediante el uso de una solución de MTT como se explicó antes y se determinó la concentración citotóxica media (CC50). Detrás, se calculó el índice de selectividad (IS) mediante la división de la CC50 entre la CI50 frente a promastigotes. Los extractos que mostraron un IS mayor o igual que 5, se evaluaron frente a amastigotes intracelulares de L. amazonensis.Actividad frente a amastigotes
Se extrajeron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c, como se describió previo. Estas células se infectaron con promastigotes estacionarios a razón de 4 parásitos por macrófago durante 4 h y se trataron con 10 µL de cada extracto a una concentración final entre 12,5 y 100 µg/mL. Después de 48 h de incubación a 37 °C y 5 % CO2, se realizaron conteos directos en cultivos teñidos por Giemsa y se calculó la CI50 frente a amastigotes. Se seleccionaron como candidatos potenciales los extractos que mostraron una CI50 menor que 50 µg/mL.
Análisis estadístico
La CI50 y la CC50 en todos los ensayos realizados se obtuvieron solo de una curva de regresión lineal y fue el resultado de la media de tres réplicas realizadas por separado. Los valores fueron comparados por Mann-Whitney, con el uso del programa STATISTICA para Windows, Versión 4.5, 1993.
De los 15 extractos evaluados frente a promastigotes de L. amazonensis, solo 4 mostraron inhibición del crecimiento de los parásitos. De estos, solo el extracto de E. lucunter, preparado a partir de la parte interna del organismo, mostró baja citotoxicidad, con un IS de 5 (tabla 2). Al evaluar dicho extracto frente a amastigotes intracelulares del parásito se obtuvo una CI50 de 28,1 ± 6,0 µg/mL; mientras que la pentamidina mostró valores de 1,3 ± 0,1 µg/mL.
En este trabajo, el 26,7 % de los productos evaluados causaron actividad frente a promastigotes de L. amazonensis. Sin embargo, solo el 6,7 % mostró selectividad y actividad frente a amastigotes intracelulares.
En la literatura revisada no se encontraron trabajos que reporten la actividad anti-leishmanial del equinoideo E. lucunter. Sin embargo, otros invertebrados marinos como esponjas, octocorales, briozoos y ascidias han mostrado efecto frente a Leishmania.14,15 De ellos se puede mencionar el extracto de Physalia physalis que mostró resultados similares (CI50 = 52,2 µg/mL en promastigotes y CI 50 = 40,5 µg/mL frente a amastigotes)14 a los hallados en este estudio, corroborándose así la potencialidad de los invertebrados marinos como posibles fuentes de metabolitos activos frente a este protozoo parásito.
Los valores de CI50 de E. lucunter (28,1 µg/mL) fueron superiores a los obtenidos con la pentamidina (1,3 µg/mL) frente a amastigotes de L. amazonensis. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que es probable que los principios activos en el extracto ocupen un bajo por ciento de la compleja mezcla de componentes que lo conforman. Para lograr una mejor eficiencia de su actividad anti-leishmanial, se podría realizar el fraccionamiento y purificación de sus componentes activos.
E. lucunter es un organismo que habita en rocas de aguas costeras hasta 45 m de profundidad, alimentándose de algas y animales que viven incrustados en la superficie de las rocas.16 Esta especie se encuentra distribuida desde Carolina del Norte (EUA) y Las Bermudas hasta Santa Catalina (Brasil), e incluye El Caribe y zonas del Este de África.16-18 Desde el punto de vista farmacológico, no se encontraron evidencias científicas sobre su utilidad terapéutica, por lo que este trabajo constituye el primer reporte sobre efecto farmacológico relacionado con esta especie. Este hallazgo permite sugerir a la comunidad científica internacional la exploración de E. lucunter como posible agente terapéutico, así como la utilización de los invertebrados marinos como fuentes de novedosos compuestos con actividad biológica.
]]> Al tener en cuenta estos resultados, se puede considerar el extracto de E. lucunter como un promisorio agente anti-leishmanial. Se sugiere que sean realizados estudios químicos con el objetivo de identificar y purificar sus posibles metabolitos activos.
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Recibido: 18 de febrero de 2015.
Aceptado: 16 de julio de 2015.
Lianet Monzote Fidalgo. Departamento de Parasitología. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”. Autopista Novia del Mediodía Km 6 ½ AP 601, Municipio Lisa, La Habana, Cuba.
Correo electrónico: monzote@ipk.sld.cu
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