Método de reacción en cadena de la polimerasa para determinar la replicación del virus de la hepatitis B

Polymerase chain reaction method to determine replication of hepatitis B virus

María Teresa Martínez Echevarría, Suchiquil Rangel Velazquez, Gissel García Menéndez, Amarilys Martínez Piedra, Pedro E. Velbes Marquetti, Raúl Pablo Ferreira Capote

Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras". La Habana, Cuba.

Objetivo: evaluar el desempeño clínico de un método de reacción en cadena de la polimerasa con modificaciones para la detección de la replicación del virus de la hepatitis B en pacientes infectados.
Métodos: se estudiaron 266 muestras de suero de pacientes provenientes de los servicios de Gastroenterología, Trasplante, Hemodiálisis y Hematología del Hospital Clínicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras", con el antígeno de superficie (HBsAg) positivo y altos valores de enzimas hepáticas (aspartatoaminotransferasa, aspartatoaminotransglutaminasa y ganmaglutamiltrasferasa), así como 5 muestras de individuos clínicamente sanos. El ADN se extrajo mediante el método del fenol-cloroformo. Se amplificó un fragmento de la región Pre S del virus de la hepatitis B y un fragmento del gen de la ß-globina como control interno de la reacción.
Resultados: El fragmento del gen de la ß-globina se verificó en las 266 muestras estudiadas. La región Pre S del virus de la hepatitis B en cambio, fue detectada en 103 de ellas, siendo informadas como positivas para la replicación viral. En la muestra se obtuvo una prevalencia 98,15 % para la replicación del virus de la hepatitis B. La especificidad clínica del ensayo fue del 100 %, la sensibilidad clínica del 38 %, el valor predictivo positivo del 100 % y el valor predictivo negativo del 64 %. El análisis de concordancia no mostró acuerdo (κ= 0,022 para una p= 0,07) entre las enzimas hepáticas y la reacción en cadena de la polimerasa. Los ensayos de repetitividad y de reproducibilidad mostraron que los resultados son reproducibles. El mayor porcentaje de positividad se encontró en los pacientes remitidos por el Servicio de Hematología (66,7 %).
Conclusiones: el método de reacción en cadena de la polimerasa evaluado constituye una herramienta certera para el monitoreo de la replicación del virus de la hepatitis B. Contar con su implementación y aplicación en la institución que se efetuó el estudio reviste gran importancia para el sistema de salud del país.

Palabras clave: virus de la hepatitis B; método diagnóstico; reacción en cadena de la polimerasa; replicación viral.

ABSTRACT

Objective: evaluate the clinical performance of a modified polymerase chain reaction method to detect replication of the hepatitis B virus in infected patients.
Methods: a study was conducted of 266 serum samples from patients cared for at gastroenterology, transplantation, hemodialysis and hematology services of Hermanos Ameijeiras Clinical Surgical Hospital with positive surface antigen HBsAg and high liver enzyme values (aspartate aminotransferase, aspartate aminotransglutaminase and gamma-glutamyltransferase), and 5 samples from clinically healthy individuals. The DNA was extracted by the phenol-chloroform method. Amplification was performed of a fragment of the Pre S region of the hepatitis B virus and a fragment of the β-globin gene as internal control of the reaction.
Results: the β-globin gene fragment was found in the 266 samples studied. The Pre S region of the hepatitis B virus, however, was detected in 103 of them. These were reported as positive for viral replication. The sample exhibited a prevalence of 98.15 % for replication of the hepatitis B virus. Clinical specificity of the assay was 100 %, clinical sensitivity was 38 %, positive predictive value was 100 % and negative predictive value was 64 %. Concordance analysis did not reveal any agreement (κ= 0.022 for p= 0.07) between the liver enzymes and the polymerase chain reaction. Repeatability and reproducibility assays showed that the results are reproducible. The highest positivity percentage was found in patients referred from the Hematology Service (66.7 %). ]]> Conclusions: the polymerase chain reaction method evaluated is an accurate tool to monitor replication of the hepatitis B virus. The possibility of its implementation and application at the institution where the study was conducted is very important for the Cuban health system.

Keywords: hepatitis B virus; diagnostic method; polymerase chain reaction; viral replication.

INTRODUCCIÓN

La hepatitis B es una infección hepática potencialmente mortal causada por el virus de la hepatitis B (VHB) y constituye un importante problema de salud a nivel mundial. Se estima que hay 240 millones de personas que padecen la infección crónica -definidas como positivas al antígeno de superficie (HBsAg) durante al menos seis meses-, y que más de 686 000 personas mueren cada año como consecuencia de la infección. Generalmente, esta infección transcurre de forma asintomática, lo que puede ocasionar cirrosis hepática, fallo hepático y hepatocarcinoma celular en el individuo infectado. Desde 1982 se dispone de una vacuna contra el VHB con una eficacia del 95 % en la prevención de la infección.^1,2

Los individuos infectados reciben una terapia antiviral, que generalmente resulta eficaz en la reducción de la replicación viral y en la normalización de la función hepática. Sin embargo, la mayoría de estos tratamientos no eliminan completamente la infección. Es por ello que se requieren de tratamientos continuos a largo plazo para mantener la supresión viral y el control de los síntomas de la infección, pero estos se ven comprometidos por la emergencia de cepas resistentes. Por este motivo se han diseñado una gran variedad de métodos que permiten diagnosticar y monitorear el curso de la infección. De ellos, la detección directa de la partícula viral en suero es uno de los más aceptados, particularmente cuando logran cubrir todas las variantes genéticas de la partícula viral, ya que permiten detectar infecciones ocultas.^3,4

En Cuba, a pesar de los esfuerzos realizados para erradicar la infección, todavía se informa una baja prevalencia del HBsAg (0,6 % en donantes de sangre), que es más elevada en grupos de riesgo como los pacientes de hemodiálisis (5,9 %). Para abordar el estudio y tratamiento de estos pacientes se precisa de una serie de marcadores serológicos, bioquímicos, histológicos y sobre todo moleculares, con los cuales no contamos debido a su alto costo, especialmente los que miden la presencia del ADN viral en muestras de suero, el cual constituye un marcador útil para evaluar la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en pacientes con hepatitis B crónica.^5-7

El presente trabajo tiene el objetivo de evaluar el desempeño clínico de un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR del inglés polimerase chain reaction) con modificaciones para la detección de la replicación del VHB en pacientes infectados

Se realizó un estudio descriptivo de corte transversal en el período comprendido de 2004 a 2006, que incluyó a 266 pacientes provenientes de los servicios de Gastroenterología (213), Trasplante (14), Hemodiálisis (16) y Hematología (23) del Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras" con al menos dos HBsAg positivos y cuadro clínico de posible replicación viral, marcado fundamentalmente por valores de aspartatoaminotransferasa (ASAT), aspartatoaminotransglutaminasa (ALAT) y ganmaglutamiltrasferasa (GGT) fuera de su rango normal. Se incluyeron, además, cinco muestras de individuos clínicamente sanos, que estuvieron de acuerdo con participar en el estudio, para realizar los ensayos de especificidad clínica.⁷

Extracción de ADN: A todos los individuos estudiados se les tomó una muestra de 3 mL sangre periférica en tubo seco. La extracción del ADN se realizó a partir de 200 µL del suero obtenido siguiendo el método de Lo Iacono.⁸ Brevemente, a los 200 µL de suero se le añadió igual volumen de fenol saturado con TE 1X. Tras agitación vigorosa durante 1 min, se centrifugó a 10 000 r.p.m. durante 5 min obteniéndose dos fases. La fase superior se transfirió a otro tubo al cual se le añadieron 200 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (CIA). Tras agitación vigorosa durante 1 min, se centrifugó a 10 000 r.p.m. durante 5 min obteniéndose dos fases. La fase superior se transfirió a otro tubo, y se le añadió 0,5 del volumen de acetato de amonio 7,5 M y 2,5 volumen de etanol absoluto. Tras una incubación a -20 ºC durante toda la noche, se centrifugó a 12 000 r.p.m., 4 ºC durante 15 min y se separó el precipitado, el cual se lavó con etanol al 70 % centrifugando a 12 000 r.p.m., 4 ºC durante 15 min. Se extrajo todo el etanol y se secó el precipitado al vacío durante 10 min. Posteriormente se resuspendió en 15 µL de H₂O libre de DNAsa y se incubó durante 20 min a 56 ºC en Baño de María.

Método PCR: Se amplificaron simultáneamente, un fragmento de 614 pb de la región Pre S del VHB y un fragmento de 264 pb del gen de la ß-globina, mediante el empleo de los cebadores que se describen en la tabla 1.^9,10 En la mezcla de reacción se incluyeron, además, buffer 1x Taq DNA Polimerasa (Promega), 0,2 μM de cada cebador, 0,4 mM de cada deoxinucleótido trifosfato (Promega), 1,5 mM MgCl₂ (Promega) y 2 unidades de Taq ADN Polimerasa (Amplicen) en un volumen de reacción de 50 µL, usando 5 µL de muestra. La reacción se realizó en un termociclador MJ Research modelo Minicycler. El programa consistió en una desnaturalización inicial a 94 ºC durante 5 min, seguida de 35 ciclos de 94 ºC por 1 min, 50 ºC por 30 s y 72 ºC por 1 min y extensión final a 72 ºC durante 5 min. Los productos se visualizaron mediante electroforesis submarina en gel de agarosa al 2 %, teñido con bromuro de etidio y exposición a luz ultravioleta. El tamaño de los fragmentos amplificados se verificó empleando en la corrida el marcador de peso molecular de 100 pb (Promega). Se consideraron positivos a la presencia de ADN del VHB aquellos casos donde, además del fragmento de 264 pb del gen de la ß-globina, se obtuvo el fragmento de 614 pb de la región Pre S del VHB.

Precisión (repetitividad y reproducibilidad): Se seleccionaron cinco muestras positivas y cinco muestras negativas al azar, las cuales fueron amplificadas por triplicado en tres sesiones de trabajo diferentes por distintos investigadores.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los datos se vertieron en una matriz de cálculo Excel.

El desempeño diagnóstico se evaluó según lo establecido en la regulación 47 del Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED).¹¹ Se determinaron la sensibilidad clínica, la especificidad clínica, el valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) y la prevalencia. También se hizo un análisis de concordancia entre el movimiento de las enzimas hepáticas y el PCR, mediante el cálculo del índice kappa de Cohen (k), considerándose significativos los valores de p £ 0,05. Se utilizó el programa Epidat para Windows, versión 3.1.

Para la caracterización de la muestra se empleó la estadística descriptiva, utilizando las frecuencias absolutas y relativas expresadas en porcentajes por tratarse de variables cualitativas, mediante el programa SPSS para Windows, versión 20.0.

RESULTADOS

El fragmento de 614 pb de la región Pre S del VHB solo se obtuvo en 103 muestras, mientras que la presencia del fragmento de 264 pb del gen de la ß-globina, utilizado como control interno, se verificó en las 266 muestras estudiadas, lo que garantizó la calidad del ensayo al confirmar con mayor certeza los resultados negativos.

Especificidad clínica: En las 5 muestras de individuos clínicamente sanos, solo se obtuvo amplificación para el gen de la ß-globina y los cálculos demostraron que el método es 100% efectivo en identificar el ciclo replicativo del VHB en los individuos infectados.

Sensibilidad clínica: La eficiencia del método para detectar la replicación del VHB es del 38,72 %.

Prevalencia: En la muestra estudiada se obtuvo una prevalencia del 98,15 % para la replicación del VHB.

VPP: La probabilidad de tener la enfermedad si el resultado de la prueba diagnóstica es positivo, es del 100 %.

VPN: La probabilidad de no tener la enfermedad si el resultado de la prueba diagnóstica es negativo es del 64%.

Análisis de concordancia: No mostró acuerdo entre las enzimas hepáticas y el PCR ya que se obtuvo una k= 0,022 para una p= 0,07.

Precisión: En las cinco muestras positivas incluidas en los ensayos de repetitividad y de reproducibilidad, se detectaron ambos fragmentos. Las muestras negativas solo mostraron el fragmento de 264 pb correspondiente al gen de la ß-globina.

DISCUSIÓN

El presente trabajo evalúa el desempeño clínico de un método de PCR con modificaciones para la detección de la replicación del VHB, el cual se basó en el diseño de los cebadores informados por Pawlotsky y otros,⁹ con la introducción de un control interno, que emplea como diana un fragmento del gen de la ß-globina, descrito por Lema y otros,¹⁰ que garantiza la confiabilidad de los resultados.

El ensayo de especificidad realizado mostró una especificidad clínica realmente alta (100 %) y permitió descartar reacciones cruzadas entre los cebadores del VHB y el genoma humano, y entre los cebadores del control interno y el genoma del VHB, todo lo cual garantiza la calidad del ensayo al confirmar con mayor certeza los resultados.^7,12-14

En cambio, la sensibilidad clínica del método, fue muy baja (38,72 %). Consideramos que este resultado pudiera explicarse debido a que las enzimas hepáticas no permiten definir adecuadamente, el estado clínico del paciente por lo que se consideran en nuestro caso un "estándar imperfecto".

Hoy sabemos que los marcadores bioquímicos se mueven con mayor frecuencia por la aparición de las complicaciones de la infección, que por la replicación de la partícula viral.^14-16 Esto explica la baja frecuencia de positividad a la replicación del VHB obtenida en las muestras de los pacientes estudiados, a pesar de que en todos ellos había sospecha clínica de replicación viral, debido a sus niveles de ASAT, ALAT y GGT. La literatura señala que cuando no está bien definido el estado clínico del paciente es apropiado realizar un análisis de concordancia.¹⁰ El hecho de no haber encontrado acuerdo entre las enzimas hepáticas y el PCR para medir la replicación del VHB, confirma una vez más la necesidad de determinar la presencia del ADN del virus en suero sanguíneo, que los marcadores serológicos y bioquímicos para demostrar la replicación viral.^2,4

La alta prevalencia a la replicación del VHB encontrada en la muestra estudiada hace que el VPP sea alto también, ya que, al haber un menor número de personas sanas, disminuye el número de falsos positivos. Es decir, como un porcentaje alto de la población está afectado, un resultado positivo del PCR es concluyente. Asimismo, el VPN es moderado porque al haber un mayor número de personas enfermas, aumenta la probabilidad de obtener falsos negativos.^12,13

El método PCR introducido por nosotros mostró una buena precisión, ya que se reprodujo exitosamente por varios investigadores, con resultados reproducibles, lo que en parte asegura su confiabilidad.¹²

La replicación viral implica daño hepático y, por consiguiente, la aparición de las complicaciones de la infección, por lo cual se hace indispensable reevaluar el tratamiento del paciente. El objetivo principal del tratamiento es obtener la supresión viral, lo que a su vez reduce la progresión de las complicaciones hepáticas, las cuales pueden terminar en hepatocarcinoma celular, trasplante de hígado e incluso, la muerte del paciente. El éxito del tratamiento consiste en obtener una supresión viral continuada, la cual puede llegar a revertir la fibrosis y, por tanto, mejorar la calidad de vida del individuo infectado. Para establecer el éxito de la terapia antiviral debe realizarse el monitoreo sistemático y constante de la ALAT y sobre todo, de los marcadores moleculares: carga viral, genotipificación del virus y replicación viral, lo cual requiere de métodos moleculares costosos.^17-21

Agradecimientos

Agradecemos la colaboración de la licenciada Madeline Blanco de Armas, Investigadora Auxiliar del Laboratorio de Investigaciones del SIDA (LISIDA), La Habana, Cuba, con quien realizamos tres estudios de control externo, empleando dos muestras a ciegas en cada uno. Los resultados fueron satisfactorios en todos los casos.

Conflicto de intereses

Los autores no declaran conflicto de intereses.

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Recibido: 3 de mayo de 2017.
Aprobado: 19 de octubre de 2017.

María Teresa Martínez Echevarría. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras". San Lázaro No. 701 entre Belascoaín y Marqués González, Centro Habana, La Habana, Cuba. CP 10300. Correo electrónico: genetica@hha.sld.cu