Descriptores DeCS: GLUTATION/deficiencia; GLUTATION SINTETASA/ deficiencia; GLUTATION SINTETASA/genética; GLUTAMATO-CISTEINA LIGASA/genética; ANEMIA HEMOLITICA CONGENITA/genética.
El glutatión reducido (GSH) es un tripéptido que se encuentra presente en elevadas concentraciones dentro del eritrocito (2 mM). Su función fundamental es proteger a la célula contra la acción de agentes oxidantes endógenos y exógenos, así como mantener la estabilidad de la membrana. También participa en el mantenimiento de la estructura de la hemoglobina, en la síntesis de proteínas en los reticulocitos, así como preserva la integridad de algunas enzimas y proteínas de la membrana.1-3
Este metabolito se sintetiza en 2 reacciones dependientes de adenosina trifosfato (ATP). En la reacción de la g -glutamil cisteil sintetasa (g -GCS) se forma un dipéptido a partir del ácido glutámico y la cisteína, y en el segundo paso actúa la glutatión sintetasa (GS), la cual agrega glicina al dipéptido g -glutamilcisteína.1,4 La deficiencia de estas 2 enzimas es muy rara, pero en ambos casos los niveles de GSH se encuentran disminuidos, por lo que fundamentalmente se produce un cuadro de anemia hemolítica de intensidad variable.4-6
Aunque en la deficiencia de g -GCS se observan niveles muy bajos de GSH, la anemia es de ligera a moderada y el patrón de herencia es autosómico recesivo.7
La deficiencia severa de GS se trasmite también de forma autosómica recesiva, y se pueden observar 2 fenotipos: anemia hemolítica aislada o enfermedad multisistémica con anemia hemolítica, acidosis metabólica, 5-oxoprolinuria y disfunción neurológica asociada con el síndrome hemolítico.4,8,9
Además de la hemólisis crónica que acompaña a estas 2 enzimopatías, los pacientes son susceptibles de presentar episodios agudos de hemólisis por estrés oxidativo con la formación de cuerpos de Heinz.4
El objetivo de este trabajo es estandarizar las ténicas de actividad de g -GCS y GS y presentar los estudios de una familia con deficiencia de GSH. ]]>
Para la actividad de la g -GCS se empleó la técnica señalada por Beutler5 y Foure-Seeling, que se basa en la siguiente reacción:10
| Reactivo | |
| Tris/HCl 1M pH 8 | |
| KCl 1M | |
| MgCl2 0,4M | |
| ATP 50 mM | |
| NADH 5mM | ]]> 40 |
| PEP 25 mM | |
| L-cisteína 100 mM | |
| L-glutámico 100 mM | |
| PK 0,5 U | |
| LDH 0,5 U | |
| Hemolizado 1/20 | |
| H2O | |
Se registró el cambio de densidad óptica (g DO) por minuto a una longitud de onda (g ) de 340 nm, en un espectrofotómetro Shimadzu UV/visible, producto de la transformación del NADH en NAD+.
Los g Hb se determinaron agregando 200 mL del hemolizado a 5 mL de solución de Drabkin y multiplicando por un factor (3,68) la absorbancia (DO) a una g de 540 nm. ]]>
Los resultados de actividad enzimática (AE) se expresaron en unidades internacionales (UI) por gramo de hemoglobina (g Hb) según la siguiente fórmula:
donde:
Glutámico + cisteína + glicina + ATP g -GCS -glutamil-cisteína + ADP + Pi
g-glutamil-cisteína + glicina + ATP GS + ADP + Pi
Se empleó un método colorimétrico midiendo el fósforo inorgánico (Pi) producido durante la reacción de la g-GCS y restándole éste al total liberado durante las 2 reacciones enzimáticas.11
El sistema de ensayo utilizado fue el siguiente: ]]>
| Reactivo | | | |
| | | | |
| Cisteína 12 mM | | | ]]> 0,4 |
| Glutámico 12 mM | | | |
| Glicina 12 mM | | | |
| ATP 12 mM | | | |
| Ditioeritrol (DTT) 12 mM | ]]> 0,2 | | |
| KCl 22,5 mM | | | |
| MgCl2 22,5 mM | | | |
| Imidazol/HCl 60 mM | |||
| PH8 | | ]]> 0,2 | |
| Hemolizado ajustado a 10 mg Hb/mL | | | |
| Incubar a 37 oC durante 1 hora | |||
| Ácido tricloro-acético al 10 % | | | |
| Hemolizado a 10 mg Hb/mL | | | ]]> - |
| Cisteína 12mM | | | |
| Glutámico 12mM | | | |
| Glicina 12mM | | | |
| Filtrar |
Se incubó 10 minutos a la oscuridad y se leyó a una l de 578 nm. Para la determinación de la concentración del dipéptido y del tripéptido se realizó una curva patrón de Pi (tabla 1).
| Reactivos | | | | | | ]]> 2,5 mM | | | | | |
| Solución I | | | | | ]]> - | | | | | | |
| Solución II | | | | ]]> - | | | | | | | |
| Solución madre | | | ]]> - | | | | | | | | |
| H2O destilada | | ]]> 1,0 | | | | | | | | | |
| TCA 10 % | ]]> 1,5 | | | | | | | | | | ]]> 1,5 |
Se mezclaron bien cada uno de los tubos y se tomaron 0,3 mL de cada uno + 50 mL de molibdato de amonio al 2,5 % + 50 mL de ácido ascórbico + 400 mL de H2O destilada.
Se leyó la DO igualmente a una l de 478 nm. Los resultados se expresaron en mM de Pi liberado/h/mL de hematíes, de acuerdo con la fórmula siguiente:
donde:
Se determinó la media (
) y la desviación estándar (±1DS) y se establecieron los valores normales de la g -GCS y GS.
Se estudió una familia con deficiencia congénita de GSH.
En 1980 los hallazgos clínicos y de laboratorio más importantes fueron: bilirrubina indirecta elevada, esplenomegalia de 2 cm, Hb 118 g/L y tinte ictérico en las esclerótidas.
Los resultados de la biopsia hepática y la laparoscopia realizada en 1981 mostraron hígado de características normales con gránulos de pigmentos biliares. Se mantuvo el aumento de bilirrubina indirecta y la hepatomegalia de 3 cm.
En enero de 1986 ingresó nuevamente y el estudio de las pruebas funcionales hepáticas y el hierro sérico fueron normales. Presentó litiasis vesicular, hepatoesplenomegalia ligera, bilirrubina indirecta elevada y Hb 134 g/L.
En febrero de 1987 fue remitida al Departamento de Enzimas del Instituto de Hematología para el estudio de una posible anemia hemolítica, donde se observó: Hb 126 g/L, conteo de reticulocitos 7,2 % y bilirrubina indirecta aumentada.
El análisis de la historia familiar mostró que G.D.R., hermano de L.D.R. ingresó en el hospital "Carlos J. Finlay" en septiembre de 1986 con el diagnóstico de sepsis generalizada. Presentaba íctero, orinas oscuras, esplenomegalia, Hb 112 g/L, conteo de reticulocitos 20 %, litiasis vesicular, antígeno de superficie de hepatitis B negativo y actividad y electroforesis de G6PD normal. M.R.A., la madre del propósito, falleció en 1978 a consecuencia de una neoplasia de cuello del útero.
Al propósito, a 2 hermanos y al padre se les realizó actividad de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PD), 6-fosfoglucónico deshidrogenasa (6PGD), glutatión reductasa (GR), g -GCS, GS y la determinación y estabilidad del GSH.10-13 Al paciente se le determinó también la actividad de piruvato kinasa (PK), fosfoglicerato kinasa (PGK), hexokinasa (Hx) y deshidrogenasa láctica (LDH). ]]>
±; 1DS) Ul/g Hb y 1,468 + 1,117 ( +1DS) mM de Pi liberado/h/mL de hematíes.
En la tabla 2 se muestran los parámetros hematológicos del propósito y los familiares estudiados. El conteo de reticulocitos se encontró aumentado en todos los casos, excepto en el padre. En un hermano (G.D.R.) y el padre se observó una disminución de las cifras de hemoglobina.
| | | |
| Propósito | | |
| Hermano (G.D.R.) | | |
| Hermano | ]]> 159 | |
| Padre | | |
| | | | | | | |
| Propósito | | | | | | ]]> 0 |
| Hermano | ||||||
| (G.D.R.) | | | | | | |
| Hermano | | | | ]]> 4,72 | | |
| Padre | | | | | | |
| Valores de | | ]]> 70 | | | | |
| referencia | | | | | |
Aunque el propósito tenía cifras de hemoglobina normales, el conteo de reticulocitos se encontró aumentado. El hermano G.D.R. presentó cifras de hemoglobina disminuidas y conteo de reticulocitos muy elevado, lo que conjuntamente con los otros resultados de laboratorio y las manifestaciones clínicas observadas, permitió concluir que es portador de una anemia hemolítica crónica. El padre y el otro hermano no presentan ninguna manifestación clínica. En el primero la hemoglobina se encontraba ligeramente disminuida y en el segundo el conteo de reticulocitos estaba ligeramente elevado.
Los resultados del estudio bioquímico permitieron descartar la presencia en esta familia de una deficiencia de G6PD, que es la eritroenzimopatía hereditaria más frecuente en nuestra población.
Los niveles de GSH disminuidos en el propósito y un hermano hicieron sospechar la posibilidad de una deficiencia de una de las 2 enzimas que intervienen en la síntesis de este metabolito y el estudio de éstas permitió demostrar que ambos son portadores de una deficiencia de GS. En el padre se observó un valor intermedio (63,9 %) y el otro hermano mostró actividad normal.
De acuerdo con el patrón de herencia de esta enfermedad, el padre, al igual que la madre, son portadores obligados, pero de variantes estructurales diferentes, ya que no existe consanguinidad entre ambos. El hermano que mostró actividad enzimática normal debe ser también heterocigótico, ya que presentaba reticulocitosis al momento del estudio y tiene antecedentes de ictericia ligera durante la infancia.
La actividad de la g -GCS estaba aumentada en todos los casos. Esto puede ser debido a que con niveles bajos de GSH (inhibidor por retroalimentación de la g -GCS), se produce una elevación de la actividad de esta enzima. Este hecho no se observa en el padre y un hermano, ya que ambos tienen niveles normales de GSH. No se puede descartar que existan otros mecanismos de control de la síntesis del GSH que se estimulen bajo determinadas condiciones, como por ejemplo, variaciones de las concentraciones normales de los aminoácidos que se encuentran involucrados en el ciclo del g -glutamil.8,9,15
El propósito y un hermano (G.D.R.) son portadores de una anemia hemolítica congénita no esferocítica (AHCNE) que se exacerba durante los procesos infecciosos, con la aparición de orinas oscuras. La presencia de litiasis vesicular, acidosis metabólica y trastornos neurológicos en esta enfermedad, han sido señalados por otros investigadores.5,6,8,15 No obstante, se ha descrito una forma benigna de la enfermedad en la cual la disminución de la actividad enzimática se detecta sólo en los glóbulos rojos.4,5,8
Aunque nuestros 2 casos presentaron litiasis vesicular, producto posiblemente de la hemólisis crónica, no se demostró ningún trastorno neurológico ni tampoco acidosis metabólica, por lo que ambos son portadores de la forma benigna de la enfermedad. Esta es la primera familia con deficiencia de GS encontrada en nuestra población.
Subject headings: GLUTATHIONE/deficiency; GLUTATHIONE SYNTHASE/deficiency; GLUTATHIONE SYNTHASE/genetics; GLUTAMATE-CYSTEINE LIGASE/deficiency; GLUTAMATE-CYSTEINE LIGASE/genetics; ANEMIA, HEMOLYTIC CONGENITAL/genetics. ]]>
1. Meister A, Tate SS. Glutathione and related g -glutamil compounds: biosynthesis and utilization. Ann Rev Biochem 1976;45:559.
2. Metabolism and function of glutatione. Trends Biochem Sci 1981;6:231.
3. Bannai S, Tateishi N. Role of membrane transport in metabolism and function of glutathione in mammals. J Membr Biol 1986;89:1.
4. The metabolic and molecular bases of inherited disease. CD-ROM. McGraw-Hill, 1997.
5. Beutler E, Gelbart T, Pegelow C. Erythrocyte glutathione syntetase deficiency leads not only to glutathione synthetase deficiency but also to glutathione-S-transferase deficiency. J Clin Invest 1986;77:38.
6. Larsson A, Zetterstroom R. Pyroglutamic aciduria (5-oxoprolinuria), and inborn error in glutathione metabolism. Pediatr Res 1974;8:852.
7. Beutler E. Hemolytic anemia in disorders of red cell metabolism. New York: Plenum Medical Book, 1978.
8. Ristoff E, Larsson A. Patients with genetic defect in the gammaglutamyl cycle. Chem Biol Interact 1998;111-112:113.
9. Anderson ME. Glutathione: an overview of biosynthesis and modulation. Chem Biol Interact 1998;111-112:1.
10. Foure-Seeling G, Meister A. Gamma glutamyl cysteil synthetase from erythrocytes. Ann Biochem 1984;141:510.
11. Boivin P, Galand C, Andre R, Debray J. Anemies hemolitiques congenitales avec deficit isole en glutathione reduit par deficit en glutathione synthetase. Nour Rev Fr Hematol 1966;6:859.
12. Beutler E, Blume KG, Kaplan JC, Löhr GW, Ramot B, Valentine WN. International Committee for Standardization in Hematology. recommended methods for red-cell enzyme analysis Br J Haematol 1977;35:331.
13. Beutler E. The gluthatione instability of drug sensitive red cell. A new method for the in vitro detection of drug sensitivity. J Lab Clih Med 1957;49:84.
14. Lestas AN, White JM. A reappraisal of the g -glutamylcysteine synthetase activity in haemolysates from normal erythrocytes by two different methods. Ann Int Biochem 1983;20:241.
15. Wellner VP, Sekura R, Meister A, Larsson A. Glutathione syntethase deficiency, an inborn error of metabolism involving the g-glutamil cycle in patients with 5-oxoprolinuria. Proc Natl Acad Sci 1974;71:2505.
Recibido: 22 de diciembre de 1998. Aprobado: 20 de enero de 1999.
Lic. Marianela Estrada del Cueto. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba.
Teléf. (537)578268. Fax(537)338979.e-mail:ihidir@hemato.sld.cu ]]>