Lic. Julio César Merlín Linares, DrC. Rinaldo Villaescusa Blanco y Lic. Ada Amalia Arce Hernández
Se purificaron anticuerpos naturales anti banda 3 de la clase IgG mediante cromatografía de afinidad con un aceptable nivel de pureza, rapidez y eficiencia, a partir de una mezcla de inmunoglobulinas humanas de uso parenteral. La obtención de estos anticuerpos naturales anti banda 3 permitirá abordar estudios posteriores acerca de su posible participación y potencial terapéutico en el fenómeno de vasooclusión en la drepanocitosis.
Palabras clave: anticuerpos naturales anti banda 3, cromatografía de afinidad, drepanocitosis, IgG, vasooclusión.
En los últimos años se han logrado avances en el conocimiento de las crisis vasooclusivas en la drepanocitosis, pero las bases de su control y prevención permanecen parcialmente desconocidas.1
Diversas investigaciones han permitido acumular información acerca de las moléculas de adhesión que se expresan tanto en eritrocitos SS como en el endotelio vascular, así como de los factores plasmáticos que participan en el fenómeno de oclusión.2-4 Ahora, no se ha logrado un concepto que unifique todos estos datos y permita un tratamiento efectivo. En la actualidad se trabaja en una dirección no considerada hasta el momento, la proteína banda 3 eritrocitaria (AE 1) y la presencia de anticuerpos naturales específicos contra la proteína banda 3 de la clase IgG.
En la drepanocitosis existe un aumento de agregados de AE 1 en la superficie del eritrocito como resultado de la oxidación aumentada y prematura, con la subsiguiente desnaturalización de la hemoglobina S, lo que trae como consecuencia su adhesión al endotelio vascular y además que dichos agregados sean reconocidos por los anticuerpos naturales anti banda 3, de ahí su importancia tanto en la etiología como en la solución de las crisis vasooclusivas en esta enfermedad.5-7 L os anticuerpos naturales específicos anti banda 3 son capaces de bloquear el fenómeno de adhesión al reconocer un área de la molécula de banda 3, ligando para su receptor endotelial.8,9
El objetivo de nuestro trabajo está relacionado con la purificación de anticuerpos naturales anti banda 3 eritrocitaria de la clase IgG a partir de una mezcla de inmunoglobulinas humanas.
Cien gramos de una mezcla de IgG humana (Sandoglobulin, ZLB) se disolvieron en 1 L de buffer L0,05 (100 mM NaCl, 10 mM NaKHPO 4, 1mM MgCl 2, 50 m g/mL PMSF, 0,08 % azida sódica, 0,05 % Nonidet NP-40, pH 7,4) y se dializó durante la noche contra el mismo buffer ajustándose a una concentración de 30 mg IgG/mL. La mezcla de IgG se depletó de material reactivo a IgG mediante una cromatografía de afinidad en Affigel-10 (BioRad, CA), a la que se inmovilizó IgG agregada, obtenida calentando una solución de IgG a 63 0 C durante 30 min.10
Los anticuerpos naturales anti banda 3 se aislaron en una columna de Affigel-15 (BioRad, CA) a la que se fijó la banda 3 obtenida a partir de la membrana de eritrocitos humanos según se describió anteriormente.11 El volumen total eluido de la corrida en Affigel-10 se cromatografió a través de la columna conteniendo banda 3, a una velocidad de flujo de 15 mL/h. A continuación se lavó la columna con buffer L0,01 (10 mM NaHPO 4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 50 m g/mL PMSF, 0,08 % NaN3 , 0,01 % NP 40, pH 7,4) durante la noche. Se eluyeron los anticuerpos anti banda 3 de la columna con 1 M NaCl, 0,1 M glicina, 0,01 % NP 40, pH 2,7. Las fracciones se colectaron en intervalos de 3 min en tubos conteniendo 25 m L 1 M Tris, pH 9,0. Las fracciones correspondientes al pico se mezclaron y dializaron contra PBS conteniendo 0,08 % NaN3.
]]> Se controló el nivel de pureza y la actividad funcional de los anticuerpos aislados mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, SDS-PAGE, de la banda 3 pura y del extracto de membrana de eritrocitos humanos e immunoblotting como sigue: el gel de la corrida electroforética se transfirió a un papel de nitrocelulosa y se incubó durante la noche con el anticuerpo anti banda 3 aislado y posteriormente con 125 I-proteína G según se describe anteriormente.12,13 La concentración de anticuerpos anti banda 3 purificados se determinó mediante el método de Lowry.14En la figura 1 se observa el fraccionamiento de la mezcla de IgG en la cromatografía de afinidad con Affigel – 15 con la proteína banda 3 acoplada.
En la figura 2 se muestra el resultado del inmunoblotting de los anticuerpos naturales anti banda 3 aislados, frente a la proteína banda 3 pura (2A) y la mezcla de proteínas del extracto de membrana de eritrocitos (2B). La concentración de anticuerpos naturales anti banda 3 de la clase IgG fue de 1,21 mg/mL.
Fig. 1. Fraccionamiento de la muestra de IgG por cromatografía de afinidad en Affigel-15 acoplada con la proteína de banda 3.
Fig. 2. Reactividad de los anticuerpos naturales aislados. A: contra proteína banda 3 pura; B: contra la mezcla de proteínas de la membrana.
Los anticuerpos naturales han ganado un considerable interés en los últimos tiempos. Los mismos se encuentran en el suero normal a bajas concentraciones y presentan afinidades 2 ó 3 veces menores que las de los anticuerpos inducidos; resuelven su aparente debilidad y ganan en funcionabilidad empleando rutas no convencionales que involucran biespecificidad15,16 o estimulación de la vía alternativa del complemento.17,18 Las evidencias sugieren que los anticuerpos naturales participan en la homeostasis tisular; se ha demostrado el papel de los anticuerpos naturales anti banda 3 en la eliminación en eritrocitos senescentes y oxidativamente estresados.19-21
Kay22 desarrolló un método de aislamiento de anticuerpos naturales anti banda 3 mediante elución de eritrocitos humanos senescentes, y demostró que estos pertenecían fundamentalmente a la clase IgG, policlonales y dirigidos contra receptores alterados de la membrana eritrocitaria.
En nuestro trabajo los anticuerpos anti banda 3 se purificaron a partir de una mezcla de IgG humana mediante cromatografía de afinidad en Affigel-15, a la que se acopló la proteína banda 3 pura obtenida de membranas de eritrocitos humanos. La mezcla de IgG humana se pasó previamente por una columna Affigel-10 a la que se acopló IgG agregada para eliminar cualquier material capaz de unir la IgG, como factor reumatoideo o anticuerpos anti idiotípicos. Es de señalar que estos anticuerpos naturales existen en el suero de donantes individuales como anticuerpos circulantes fundamentalmente y no como inmunocomplejos, teniendo en cuenta que fueron demostrados en preparaciones de IgG empleadas por vía parenteral como sustitutos de inmunoglobulinas.
]]> Consideramos que el método empleado posibilita la obtención de anticuerpos anti banda 3 de la clase IgG con rapidez, eficiencia y un aceptable nivel de pureza, lo que permitirá abordar estudios posteriores acerca de su posible participación y potencial terapéutico en el fenómeno de vasooclusión en la drepanocitosis.Natural anti-band 3 IgG antibodies were purified by affinity chromatography with an acceptable level of purity, rapidity and efficiency, starting from a mixture of human immunoglobulins of paren teral use. The attainment of these natural anti-band 3 antibodies will allow further studies on their possible participation and therapuetic potential in the phenomenon of drepanocytosis vasoocclusion.
Key words: natural anti-band 3 antibodies, affinity chromatography, drepanocytosis, IgG, vasoocclusion.
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Recibido: 22 de diciembre del 2006. Aprobado: 15 de enero del 2007.
Lic. Julio César Merlín Linares . Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado Postal 8070, Ciudad de La Habana, CP 10800, Cuba. Tel (537) 6438268, 6438695, 6434214, Fax (537) 442334. e -mail: ihidir@hemato.sld.cu