Efecto in vitro de la espirulina sobre los linfocitos humanos de donantes sanos y pacientes con inmunodeficiencia celular
In vitro effect of Spirulina on the human lymphocytes of healthy donors and patients with cellular immunodeficiency
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Lic. Lázaro O. del Valle Pérez; Lic. Bertha B. Socarrás Ferrer; Dra. Vianed Marsán Suárez; Lic. Isabel Torres Leyva; Dra. Miriam Sánchez Segura; Lic. Yanelkys Cos Padrón; Dra. Consuelo Macías Abraham; Dr. Porfirio Hernández Ramírez; Dr. José M. Ballester SantoveniaInstituto de Hematología e Inmunología. Cuba
RESUMEN
La espirulina (Spirulina sp) es un alga cianofícea empleada como suplemento alimentario y por sus propiedades medicinales. Se realizó este trabajo para evaluar el efecto in vitro de la esprirulina (Spirel, Génix, Ciudad de La Habana, Cuba) en 30 pacientes con diagnóstico de inmunodeficiencia celular y en 20 donantes sanos del Instituto de Hematología e Inmunología mediante las pruebas de transformación linfoblástica con criterio de timidina tritiada; en la expresión de los antígenos de activación HLA-DR y CD25 por el ultramicrométodo inmunocitoquímico y la formación de roseta activa. En la transformación linfoblástica con criterio de timidina tritiada no se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre las condiciones experimentales sin y con espirulina, tanto en los pacientes con inmunodeficiencias celulares como en los donantes sanos, mientras que se hallaron diferencias estadísticamente significativas (p£0,001) al aplicar la prueba t de Student para muestras pareadas entre las condiciones experimentales sin y con espirulina, tanto en la expresión de los antígenos de activación como en la formación de roseta activa en ambos grupos analizados. Se concluye que la espirulina de producción cubana influye positivamente en el proceso de activación de los linfocitos humanos.
Palabras clave: espirulina, transformación blástica, roseta activa, linfocitos, marcadores de activación, ultramicrométodo inmunocitoquímico. ]]>
ABSTRACT
Spirulina (Spirulina spp) is a Cyanophyceae alga used as a dietary supplement and for its medicinal properties. This paper was aimed at evaluating the in vitro effect of spirulina (Spirel, Génix, Havana City, Cuba) on 30 patients with diagnosis of cellular immunodeficiency and on 20 healthy donors from the Institute of Hematology and Immunology by the lymphoblastic transformation tests with tritiated thymidine, expression of HLA-DR and CD25 activation antigens by the immunocytochemical ultramicromethod, and the formation of active rosette. In the lymphoblastic transformation with criterion of tritiated thymidine, no statistically significant differences were found under the experimental conditions with and without spirulina, both in patients with cellular immunodeficiencies and in sound donors. Statistically marked differences (p 0,001) were detected on applying the Student's t test for matched samples between the experimental conditions with and without spirulina in the expression of the activation antigens and in the rosette formation in the analyzed groups. It was concluded that spirulina produced in Cuba exerted a positive influence on the activation process of human lymphocytes.
Key words: Spirulina, blastic transformation, active rosette, lymphocytes, activation markers, immunocytochemical ultramicromethod.
INTRODUCCIÓN
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La espirulina (E) es un alga cianofícea que crece y se multiplica en aguas con alcalino. Su nombre se deriva del latín espiral o helix debido a su configuración física; carece de núcleo y otros organelos, presenta pigmentos verdes (clorofila) azules (ficocianina) con efectos antiinflamatorios y antioxidantes.1-3
Se conoce el uso como alimento de la E desde la antigüedad, y en las últimas décadas ha sido muy estudiada porque constituye una fuente de nutrientes como: proteínas (entre el 65 y 70 %, con todos los aminoácidos esenciales, a diferencia de la carne que posee el 22 % de proteínas); lípidos (abundantes ácidos grasos esenciales, como el ácido gammalinoleico, precursor de la síntesis de la prostaglandina); las vitaminas tiamina (vit B1), riboflavina (vit B2), niacina (vit B3), ácido pantoténico (vit B5) piridoxina (vit B6), biotina (vit B8), ácido fólico, inositol, cobalamina (vit B12), tocoferol (vit E); y minerales (potasio, calcio, zinc, magnesio, manganeso, selenio, hierro y fósforo).4,5
La espirulina posee actividad antiviral que se atribuye en parte a su contenido en sulfoglicolípidos, lo que puede estar relacionado con su capacidad para aumentar la respuesta inmune y estimular la función de los macrófagos y de las células NK.6-12 Se realizó este trabajo para determinar el efecto in vitro de la espirulina sobre los linfocitos humanos de donantes sanos y de enfermos con diagnóstico de inmunodeficiencia celular.
MÉTODOS
Se estudió el efecto in vitro de la E sobre los linfocitos procedentes de 20 donantes voluntarios del Servicio de Medicina Transfusional del Instituto de Hematología e Inmunología y 30 enfermos con diagnóstico de inmunodeficiencia celular, que no habían recibido ningún medicamento en el mes anterior a la extracción de la muestra. En cada caso, se extrajeron 20 de sangre heparinizada (15 UI/) con jeringuillas plásticas desechables. El aislamiento de células mononucleares se efectuó según el método de Böyum modificado sobre un gradiente de Ficoll-Hypaque (densidad 1,077g/) (Sigma, EE.UU.).13
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Preparación de la solución de E (Spirel, Génix, Ciudad de La Habana): se trituró la tableta (400 mg), se diluyó en 10 de medio RPMI 1640, se incubó (1 h a 4 °C), se centrifugó (2 500 rpm, 4 °C, 15 min). El sobrenadante se esterilizó (filtro 22 mm, Vygon, Francia) y la concentración final de la solución fue de 40 mg/mL.Para evaluar la respuesta a la E se utilizó la prueba de transformación linfoblástica con criterio de timidina tritiada en una concentración de 2x105/pocillo en placas de 96 pozos (NUNC, Dinamarca) en 200 mL de medio RPMI 1640 al 20 % de suero fetal bovino (Sigma, EE.UU.) sin exposición a la E y con diluciones dobles de este producto desde 1:4 hasta 1:4096 durante 72 h a 37 °C, en atmósfera húmeda al 5 % de CO2 en una incubadora (ASSAB, Suecia). Para determinar la viabilidad celular se utilizó la técnica de exclusión del azul tripán, que en todos los casos fue superior al 98 %. Seis horas antes de culminar el cultivo se le añadió a cada pozo 1 mCi de timidina tritiada (Amersham, Inglaterra), (actividad específica 20 Ci/mmol). Las placas se procesaron en un cosechador de células (Flow Laboratories, Inglaterra). La detección de partículas b se realizó en un equipo RAK b (LKB, Suecia). Los resultados se expresaron en conteos por minuto (CPM).
La determinación de los antígenos de activación HLA-DR y CD25 se realizó sin y con la estimulación de E (dilución óptima de 1:64) durante 72 h en las mismas condiciones empleadas para la transformación blástica y el porcentaje de estos antígenos se efectuó por el ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ).14
El estudio del efecto de la E sobre la formación de roseta activa (RA) se realizó sin y con incubación con E (dilución óptima 1:64) a 4 °C durante las 24 h previas a la misma.15
Para comparar los resultados obtenidos entre las muestras que se expusieron a la E y aquellas en que no se usó este producto, se utilizó la prueba estadística t de Student para muestras pareadas.
Bioética: a los pacientes y donantes se les explicó el objetivo del estudio, los posibles beneficios derivados de los resultados y la ausencia de riesgos asociados. Se confeccionó una planilla para el consentimiento informado de los donantes y enfermos que participaron en el mismo.
RESULTADOS
En la transformación blástica no se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los linfocitos cultivados con y sin E, tanto en los donantes como en los enfermos. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas (p£ 0,001) en la RA y en los marcadores de activación entre los linfocitos cultivados sin y con la dilución de E (1:64) de los donantes y de los enfermos (figura 1 y tabla 1) ]]>
DISCUSIÓN
La E no produjo aumento de la proliferación de los linfocitos humanos procedentes de donantes sanos y de enfermos con inmunodeficiencia celular utilizando como criterio la incorporación de timidina tritiada al ADN de nueva síntesis, resultados que coinciden con lo observado por otros autores. Esto es causado por uno de los componentes de la E que inhibe la entrada de la timidina tritiada al linfocito.4,16
La E in vitro aumentó de forma significativa (p£0,001) la expresión de las moléculas de activación HLA DR y CD25, así como la formación de RA, posiblemente por una sobreexpresión de la molécula CD2, tanto en los linfocitos de los donantes sanos como de los enfermos con inmunodeficiencia celular. Hallazgos similares se han reportado por otros autores en estudios con individuos sanos, pero no hemos hallado en la literatura revisada el estudio del efecto in vitro de la E sobre los linfocitos de enfermos con diagnóstico de inmunodeficiencia celular.17
La E in vitro aumentó el porcentaje en la formación de RA y de expresión de los marcadores de activación con valores superiores en los linfocitos de los enfermos en comparación con los de donantes, pero no de forma significativa. En estudios con inmunomoduladores inespecíficos se ha comprobado que algunos requieren de un sistema inmunológico funcional, otros tienen sus máximos efectos sobre un sistema inmunológico deprimido, y otros que actúan tanto sobre sistemas normales como inmunodeprimidos, este último se corrobora con lo obtenido en nuestra experiencia.18
La acción in vitro de la E tanto en la sobreexpresión de los marcadores de activación como en la formación de RA, podría deberse al efecto sinérgico de todos los componentes de la E, los cuales no presentan efectos secundarios ni crean dependencia. Las vitaminas y minerales
presentes en la E constituyen preparados farmacéuticos conocidos, se sabe que el consumo de estos en su fuente natural presenta algunas ventajas, ya que se encuentran enlazados a complejos de proteínas, hidratos de carbono, lípidos y quelatos, los que en su conjunto son fácilmente asimilables y reconocidos por el organismo, a diferencia de sus análogos sintéticos, que suelen además presentar cambios sustanciales en la estructura química.4,19
Teniendo en cuenta que la E no es un medicamento, sino un suplemento alimentario, podría utilizarse como inmunoestimulante en aquellos enfermos que lo necesiten, por lo que es necesario continuar realizando los estudios preclínicos y clínicos necesarios; además, sería interesante realizar estudios de marcadores de membrana linfocitaria en linfocitos sin y con estimulación con E con el empleo de la citometría de flujo.
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AgradecimientosAgradecemos a las técnicas Lourdes Palma Salgado, Martha Ponce Sandoval, Mónica García Cuéllar, Yamila Junco y Gladys Graña Ayllón, del Instituto de Hematología e Inmunología, por la colaboración brindada en la realización de este trabajo.
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Recibido: 15 de diciembre del 2007.
Aprobado: 3 de enero del 2008.
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Lic. Lázaro O. del Valle Pérez.
Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado Postal 8070, Ciudad de La Habana, CP 10800, Cuba. Tel (537) 6438268, 6438695, 6434214. Fax (537) 6442334. e-mail: ihidir@hemato.sld.cu
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