Ensayo inmunoenzimático para la determinación de anticuerpos naturales anti banda 3
Immunoenzimatic assay to determine the natural anti-band 3 antibodies
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Lic. Ada Amalia Arce Hernández; DrC. Rinaldo Villaescusa Blanco; Lic. Julio César Merlín Linares
Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba.
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RESUMEN
Se estandarizó un método inmunoenzimático (ELISA) para la determinación de anticuerpos naturales anti banda 3 acoplando a placas Chemobond la proteína banda 3 obtenida a partir de la membrana de eritrocitos humanos mediante una combinación de cromatografía de intercambio aniónico y afinidad. Se emplearon 3 mg de la proteína banda 3 por pozo, lográndose un nivel de detección de 1 mg/mL de anticuerpo anti banda 3. Los resultados indican la utilidad del método para su empleo en la medición de los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en pacientes con drepanocitosis, tanto en estado basal como en las crisis vasooclusivas dolorosas.
Palabras clave: anticuerpos naturales anti banda 3, drepanocitosis, ELISA, proteína banda 3.
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ABSTRACT
An immunoenzimatic assay (ELISA) was standardized to determine the natural anti-band 3 antibodies by coupling with Chemobond plates the band 3 protein obtained from the membrane of human erythrocytes by a combination of affinity and anion exchange chromatography. 3 g of band 3 protein per well were used. A level of detection of 1 g/mL of anti-band 3 antibody was achieved. The results showed the usefulness of the method to measure the levels of natural anti-band 3 antibodies in patients with drepanocytes, both in basal state and in the painful vasocclusive crises.
Key words: natural anti-band 3 antibodies, drepanocytosis, ELISA, band 3 protein.
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INTRODUCCIÓN
En hemoglobinopatías como la drepanocitosis, b- talasemia y deficiencias de G6PD, ocurre la agregación de la proteína banda 3 presente en la membrana del eritrocito como resultado de la oxidación y desnaturalización posterior de la hemoglobina, lo que trae como consecuencia 2 cambios significativos: primero, estos hematíes adquieren naturaleza adhesiva y segundo, los agregados de banda 3 son reconocidos por anticuerpos naturales anti banda 3.1,2 Se plantea que para que ocurra el proceso de vasooclusión se requiere de la presencia de células adhesivas a las que no se han unido anticuerpos naturales anti banda 3. 3,4 Una deficiencia relativa de los anticuerpos naturales anti banda 3 sea por exceso de células adhesivas o por disminución de los niveles de anticuerpos, posibilita a los eritrocitos SS portadores de agregados de la proteína banda 3 adherirse al endotelio. 5 Lo anterior indica la participación de los anticuerpos naturales anti banda 3 tanto en la etiología como en la solución de las crisis vasooclusivas, de ahí la importancia de su medición en pacientes con drepanocitosis.6,7
En nuestro trabajo nos propusimos desarrollar un método inmunoenzimático para la determinación de anticuerpos naturales anti banda 3 acoplando a placas Chemobond la proteína banda 3 obtenida a partir de eritrocitos humanos.
MÉTODOS
Se estudiaron muestras de suero de 18 enfermos adultos con el diagnóstico de drepanocitosis: 6 con crisis vasooclusiva dolorosa sin síntomas ni signos de infección u otras complicaciones clínicas, y 12 en estado basal, sin manifestaciones clínicas en los 3 meses previos a la obtención de la muestra. Se incluyeron 8 controles sanos. ]]>
Purificación de la proteína banda 3
Se obtuvo a partir de la membrana de eritrocitos humanos mediante extracción con diisopropilfluorofosfato (DFP) y Tritón X - 100 y posterior combinación de cromatografías de intercambio aniónico en DEAE_celulosa y de afinidad empleando una resina p-(chloro- mercuri) benzamido]ethyl]-Sepharose 4B, eluyendo la proteína banda 3 con un gradiente continuo de L- cisterna.8,9
Acoplamiento de la proteína banda 3 a la placa Chemobond ]]>
Se añadieron 150 mL/pozo de una solución de 20 mg/mL de la proteína banda 3 resuspendida en solución amortiguadora de acoplamiento (10 mM NaKHPO4, 0.5 M NaCl, 10 mM NaBH3CN, 0,1 % Tritón X 100, pH 6,8). La placa Chemobond se incubó a temperatura ambiente durante la noche. El sobrenadante en los pozos se eliminó y los grupos aldehídos no reactivos se redujeron añadiendo 300 mL/pozo de una solución de 1 mg/mL NaBH4 en PBS (10 mM Na KHPO, 150 mM NaCl, pH 7,4), incubando 1h a 4 °C. A continuación las placas se lavaron 15X con solución amortiguadora Replica
(20 mM Tris_HCl, 0;9 % NaCl, 0,08 % NaN3, pH 7,4). Las placas se conservaron en el buffer de lavado a 4 °C hasta su uso.10
Ensayo inmunoenzimático para la determinación de anticuerpos naturales anti banda 3
En placas Chemobond, con la proteína banda 3 inmovilizada, se añadieron 150 mL/pozo de una solución de anticuerpos naturales anti banda 3 que correspondían a 0,5; 0,75, 1mg, 2mg, 4mg, 8mg y 16 mg/mL; así como diluciones dobles de sueros de pacientes con drepanocitosis en estado basal y crisis vasooclusiva dolorosa y controles sanos (1/100 hasta 1/800), en solución amortiguadora GPBS (10 mM NaKHPO4, 150 mM NaCl, 0,1 % gelatina, pH 7,4). Se aplicó cada muestra por triplicado, incubándose las placas a 30, 60, 90 y 120 min a 37 ºC. Los pozos se lavaron 3X con solución amortiguadora GPBS conteniendo Tween 20 al 0,05 %, y se incubaron 1 h a 37 ºC con un conjugado anti IgG humana-fosfatasa alcalina a la dilución de trabajo planteada por el proveedor (Sigma, St. Louis, MI), 1:9000 (150 mL/pozo). Los pozos se lavaron 3X con GPBS- Tween 20 al 0,05 %, 3X con PBS y 1X con agua destilada. Se preparó la solución de sustrato, p- nitrofenil fosfato, acorde a las instrucciones del proveedor (Sigma, St. Louis, MI), añadiéndose 150 mL/pozo e incubándose 1 h a 37 ºC. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de microplacas PR _ 521 (Tecno SUMA, Cuba).
En el estudio estadístico se calculó la media, desviación estándar y el coeficiente de variación para las variables que lo requerían en el ensayo. El límite de detección se estableció a partir de una solución de anticuerpos naturales anti banda 3 de concentración conocida (1 mg/mL), preparando diferentes diluciones que abarcaron desde 0,5_16 mg/mL, desarrollando a continuación el ensayo inmunoenzimático. Se aplicó el análisis de varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis para investigar las diferencias de los grupos de pacientes con los controles sanos.11 ]]>
RESULTADOS
El coeficiente de variación intra e inter ensayo, en series por triplicado, fue de 6,1 y 6,6, respectivamente.
El método permitió detectar concentraciones de anticuerpos naturales anti banda 3 de 1 mg/mL, estableciéndose la dilución de 1/400 como la óptima para los sueros problemas y controles sanos.
Se seleccionó un tiempo de incubación de las muestras problema de 60 min a 37 ºC, al comparar los valores de densidad óptica obtenidos en los diferentes tiempos de incubación.
Se demostró diferencia estadística al comparar los niveles de anticuerpos anti banda 3 de los grupos de pacientes con los controles sanos (p < 0,0001), no así entre los 2 grupos de pacientes estudiados (tabla).
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DISCUSIÓN
El método estandarizado presentó un nivel de detección adecuado, que fue capaz de detectar concentraciones de anticuerpos naturales anti banda 3 de 1 mg/mL. En cuanto a la reproducibilidad y repetibilidad, se lograron coeficientes de variación intra e inter ensayo de 6,1 y 6,6, valores inferiores al 10 %, parámetro establecido para sistemas similares. La dilución óptima de las muestras de 1/400, se seleccionó donde la relación de absorbancia entre los controles positivos y sus respectivos controles negativos fuera mayor de 10 veces.12
La mayoría de los ensayos inmunoenzimáticos están basados en la adsorción física de las proteínas a la superficie de poliestireno de la placa.13,14 La fortaleza y reversibilidad de esta unión a la superficie de la placa dependen de las propiedades intrínsecas de la proteína. Aquellas proteínas que requieren detergentes para permanecer en solución, como por ejemplo, las proteínas integrales de membrana solubilizadas, en particular la proteína banda 3 obtenida a partir de eritrocitos humanos, no se adsorbe adecuadamente a la placa debido a la acción de los detergentes, lo que conlleva resultados poco reproducibles. En nuestro ensayo seleccionamos las microplacas Chemobond, que son placas de poliestireno modificadas en su superficie, portadoras de aldehídos como grupos funcionales, lo que permite la unión irreversible de las proteínas con los mismos; esto nos posibilitó estandarizar un sistema reproducible y de alta sensibilidad.10
En nuestro trabajo se demostró la utilidad del método; en ambos grupos de pacientes estudiados, en estado basal y con crisis vasooclusiva dolorosa, se observó una disminución significativa de los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 al compararlos con los controles sanos, lo que pudiera estar relacionado, fundamentalmente, con un consumo aumentado de estos debido a su participación en el aclaramiento de eritrocitos SS. 15,16 Aún cuando se observa cierta tendencia a la disminución de los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en el grupo con crisis vasooclusiva dolorosa, no se demostró diferencia estadística al compararlos con los pacientes en estado basal. Es de señalar el escaso número de pacientes estudiados, por lo que sería importante aumentar el tamaño de la muestra.
Consideramos que el ensayo inmunoenzimático estandarizado es sensible, preciso, sencillo y rápido, por lo que su introducción resulta de gran importancia para el estudio de los niveles de anticuerpos naturales anti banda 3 en pacientes con drepanocitosis fundamentalmente.
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Recibido: 10 de junio de 2008.
Aprobado: 8 de agosto de 2008.
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Lic. Ada Amalia Arce Hernández. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. e-mail: ihidir@hemato.sld.cu
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