ARTÍCULO ORIGINAL
Anticuerpos contra células del trofoblasto en el primer trimestre
del embarazo
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Antibodies against trophoblast cells in the first quarter of pregnancy
Dra. María E. Alfonso-Valdés,I Dr. Eduardo Muñiz,II DrC. Antonio Bencomo-Hernández,I Dr. Rodisnel Rodríguez-Leyva,I Dra. Déborah Villegas-Cruz,III Dra. Rosa M. Lam-Díaz,I Lic. Luz M. Morera-Barrios,I Téc. Lisette Orbeal-Aldama,I Téc. Gladys Graña-AyllónI ]]>
I Instituto de Hematología e Inmunología. La Habana, Cuba.
II Hospital "Sant Pau". Barcelona, España.
III Hospital General Docente "Enrique Cabrera". La Habana, Cuba.
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RESUMEN
Las células del trofoblasto no expresan los antígenos HLA clásicos de clase I (A, B, C), pero sí los antígenos HLA G que pueden generar anticuerpos capaces de tener reacción cruzada con los primeros. Se estudiaron 24 mujeres en el primer trimestre del embarazo, sin antecedentes de embarazos o transfusiones de sangre, con anticuerpos reactivos contra leucocitos, plaquetas o ambos (9 antigranulocitarios y 15 anti-HLA), para determinar la presencia de anticuerpos antitrofoblasto, mediante técnica de inmunofluorescencia indirecta en lámina. El 54,16 % presentó anticuerpos antitrofoblasto. El 86,66 % de las embarazadas con anticuerpos anti-HLA, presentó anticuerpos contra trofoblasto, mientras que ninguno de los sueros con anticuerpos específicos de granulocitos reaccionó con las células trofoblásticas (p=0,00). Después de la adsorción con tejido trofoblástico, los sueros con anticuerpos con especificidad granulocitaria mantuvieron la reactividad con leucocitos de sangre periférica, y solo 2 de los que presentaban especificidad HLA. Los resultados sugieren que la mayoría de los anticuerpos anti-HLA, reactivos con leucocitos, plaquetas o ambos, pueden estar dirigidos contra antígenos HLA-G del trofoblasto y muestran reacción cruzada con los antígenos HLA leucocitarios, lo cual favorece el bloqueo de la respuesta de los leucocitos maternos contra las células fetales, lo que pudiera explicar, además, la alta prevalencia de anticuerpos anti-HLA en el embarazo temprano.
Palabras clave: Aloinmunización, anticuerpos antitrofoblasto, embarazo, anticuerpos anti-HLA, anticuerpos antigranulocitarios, HLA-G.
ABSTRACT
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Trophoblast cells do not express classical HLA class I antigens (A, B, C), but they do express HLA G antigens which may generate antibodies capable of cross-reacting with the former. A study was conducted of 24 women in the first quarter of pregnancy, with no previous pregnancies or blood transfusions, with reactive antibodies against leukocytes, platelets or both (9 antigranulocytary and 15 anti-HLA), to determine the presence of antitrophoblast antibodies, by plate indirect immunofluorescence technique. 54.16 % had antitrophoblast antibodies. 86.66 % of the pregnant women with anti-HLA antibodies had antibodies against the trophoblast, whereas none of the sera with granulocyte specific antibodies reacted with trophoblastic cells (p=0,00). Following adsorption with trophoblastic tissue, the sera with antibodies showing granulocyte specificity remained reactive with peripheral blood leukocytes, as opposed to just 2 of those showing HLA specificity. Results suggest that most anti-HLA antibodies reactive with leukocytes, platelets or both, may be aimed against trophoblast HLA-G antigens, and cross-react with leukocyte HLA antigens, which facilitates blockage of the response of maternal leukocytes against fetal cells. This may also explain the high prevalence of anti-HLA antibodies during early pregnancy.
Key words: Alloimmunization, antitrophoblast antibodies, pregnancy, anti-HLA antibodies, antigranulocytary antibodies, HLA-G.
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INTRODUCCIÓN
El feto es un trasplante semialogénico y por lo tanto, sigue las leyes de aceptación y rechazo inmunológico. La placenta actúa como una barrera inmunológica activa, permitiendo que 2 organismos antigénicamente diferentes se toleren el uno al otro. La tolerancia hacia el feto se lleva a cabo por la interacción de las células NK, las moléculas HLA G, el balance de citocinas Th1 y Th2, los mecanismos de apoptosis y la síntesis de factores reguladores como citocinas y hormonas.1
Las células trofoblásticas no expresan los antígenos (Ags) HLA clase I clásicos (A, B, C), pero expresan Ags HLA clase I no clásicos como los HLA-G. La proteína HLA-G unida con membrana se expresa selectivamente en las células epiteliales del amnio, las células endoteliales fetales, los macrófagos del mesénquima de las vellosidades coriónicas y las células epiteliales de la médula del timo, pero su mayor expresión se observa en las células del citrofoblasto extravelloso de la placenta. Las formas solubles se encuentran en el líquido amniótico, en la sangre periférica materna y en la de cordón.2-6
La fuerte expresión de las moléculas HLA-G en el trofoblasto y sus acciones sobre el sistema inmune, tales como el efecto inhibitorio sobre la actividad de los linfocitos T citotóxicos y las células NK,7,8 sugieren que estas moléculas contribuyen a la protección del feto semialogénico contra la lisis de estas células maternas.9-11
El embarazo exitoso se describe como un "fenómeno Th2" caracterizado por la producción de las citocinas de ese perfil, IL-10, IL-3, IL-4.12 En contraposición, algunas complicaciones del embarazo, tales como el aborto espontáneo y la pre-eclampsia, se asocian con una respuesta Th1, con producción de IL-2, factor de necrosis tumoral e interferón gamma.13
La desviación hacia la respuesta Th2 que se produce en el embarazo, puede favorecer la producción de anticuerpos (Acs). La importancia de la presencia de Acs en el embarazo es objeto de controversia. Algunos autores plantean que los Acs dirigidos contra antígenos fetales pueden desempeñar un papel importante en la fisiopatología de algunos casos de desprendimiento prematuro de placenta, además de producir citopenias aloinmunes neonatales.14-16 Otros plantean que pueden actuar como Acs anti-idiotipos que evitan la respuesta inmune mediada por células, dañina para el feto, enmascarando los Ags trofoblásticos o cubriendo los receptores de los linfocitos T maternos.
Se ha reportado una mayor frecuencia en la producción de Acs bloqueadores en embarazos normales, lo que sugiere que estos pueden proteger al feto del aborto y existen evidencias de que las mujeres compatibles con su pareja en los alelos HLA DQA1, fallan en la producción de aloanticuerpos y experimentan abortos recurrentes.17
En un estudio realizado durante el primer trimestre del embarazo en mujeres sin antecedentes de embarazos o transfusiones, se detectó una frecuencia alta (30 %) de Acs reactivos contra leucocitos, plaquetas o ambos, en un período temprano del embarazo (9-10 semanas de gestación), lo que no ha sido reportado por otros autores.18-20 Esta frecuencia es similar a la hallada en otros estudios en segundos o terceros embarazos a término.21-24 Considerando que las células del trofoblasto expresan Ags HLA G que tienen similitudes estructurales con los Ags HLA clase I clásicos, se decidió evaluar si los Acs reactivos con leucocitos y plaquetas eran capaces de reaccionar también con Ags presentes en las células trofoblásticas y valorar la significación de los resultados obtenidos.
En Cuba no se ha realizado ninguna investigación con esta temática; en la literatura científica internacional los trabajos en este tema son poco numerosos y recientes, y quedan aún importantes aspectos por esclarecer acerca de la participación del sistema inmune en la fisiología del embarazo. ]]>
MÉTODOS
Se seleccionaron para el estudio 24 mujeres en el primer trimestre de la gestación, sin antecedentes de embarazos previos ni transfusiones de sangre o sus componentes, cuyos sueros eran reactivos contra leucocitos, plaquetas o ambos, en algunas de las técnicas empleadas: linfocitotoxicidad (LCT),25 inmunofluorescencia indirecta en plaquetas (PIF),26 inmunofluorescencia en granulocitos (GIF)27 y aglutinación de granulocitos (GAG).27
El 62,5 % de los sueros (n=15) presentaban especificidad anti HLA, 12 eran reactivos en la técnica de LCT, sola o combinada, y 3 PIF positivos, MAIPA (antígenos plaquetarios inmovilizados por anticuerpos monoclonales) negativos. La técnica de MAIPA permite detectar Acs dirigidos contra Ags específicos de plaquetas. El 37,5 % restante presentaba especificidad antigranulocitaria, ya que fueron reactivos en GIF, GAG o en ambas.
Se estudió la presencia de Acs contra células trofoblásticas en el suero de las embarazadas. Para ello se empleó una técnica de inmunofluorescencia indirecta en lámina, utilizando tejido trofoblástico obtenido a partir de placentas normales, con un método similar al de detección de Acs antinucleares, pero con modificaciones.28
Obtención de tejido trofoblástico. Se obtuvo a partir de placentas de grupo sanguíneo "O" para evitar la interferencia de los anticuerpos ABO, después de múltiples lavados para eliminar la contaminación con eritrocitos. En láminas portaobjeto se fijaron cortes de tejido trofoblástico, fijadas con acetona y que se conservaron en congelación a -20 0C hasta su utilización. ]]>
Inmunofluorescencia indirecta para la detección de Acs antitrofoblasto. A cada corte de tejido trofoblástico se le añadieron 50 mL del suero a estudiar y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en cámara húmeda. Se aplicaron 3 lavados con solución buffer de fosfato (PBS) a pH 7, se secaron y se añadieron 50 mL de suero de conejo antiglobulinas humanas (fracción fab' 2), conjugado con isocianato de fluoresceína en la dilución de trabajo (1:60 en PBS). Después de una incubación de 30 min en cámara húmeda a oscuras, se aplicaron 3 lavados con PBS, se secaron y se guardaron en cámara húmeda a oscuras hasta su lectura en un microscopio de fluorescencia. Como controles negativos se emplearon suero AB, suero sin Acs, y sueros adsorbidos. Como control positivo se utilizó suero anti H monoclonal humano de la clase IgG.
Una alícuota de los sueros de las embarazadas con anticuerpos reactivos contra leucocitos, plaquetas o ambos, fueron adsorbidos con tejido trofoblástico obtenido a partir de placentas de grupo "O".29
A los sueros adsorbidos se les repitió el estudio de detección de Acs contra leucocitos y plaquetas, con las mismas técnicas empleadas en la detección inicial.
Para el análisis estadístico se realizó la comparación de frecuencias, mediante el estadígrafo X2. En el análisis de las muestras pareadas se utilizó la prueba de Mc Nemar.
A todas las embarazadas se les solicitó un consentimiento informado explicando las características del estudio, la confidencialidad de los resultados obtenidos, así como la posibilidad de retirarse del estudio si lo considerara oportuno.
RESULTADOS ]]>
El 54,16 % de los embarazadas estudiadas presentaron Acs anti trofoblasto.
El 86,66 % de los sueros con Acs con especificidad HLA presentaron Acs contra trofoblasto, mientras que ninguno de los sueros con Acs dirigidos contra granulocitos, presentó Acs contra trofoblasto (tabla 1).
Después de adsorbidos con tejido trofoblástico, el 86,6% de los sueros con anticuerpos con especificidad anti HLA fueron no reactivos contra leucocitos, plaquetas o ambos, mientras que todos los sueros con Acs con especificidad anti granulocitaria mantuvieron la reactividad después de la adsorción (tabla 2). Esto demuestra que solo los Acs con especificidad HLA reaccionan con las células del trofoblasto y teniendo en cuenta que estas células no expresan moléculas HLA clase I clásicas, se presume que la reacción se produce contra antígenos HLA-G.
DISCUSIÓN
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Entre los mecanismos que se sugieren en la protección del embarazo por parte de las células del trofoblasto, se encuentran la ausencia de expresión de moléculas HLA clase I y II clásicas, la expresión de moléculas HLA-G, la producción de apoptosis de células T CD8+ por la vía FAS/FASL, la expresión de proteínas reguladoras del complemento (CD 46, CD 55, CD 59), así como la presencia de células del trofoblasto muertas en la circulación materna que proveen una fuente de Ags de origen paterno, que provocan tolerancia y regulan la respuesta inmune materna contra el feto.30-34Las células que no expresan moléculas HLA clásicas del sistema principal de histocompatibilidad en su superficie, suelen sufrir lisis mediada por células NK, lo que no ocurre con las del trofoblasto humano.35 Algunos autores plantean que estas células pueden ser reconocidas por linfocitos T gamma/delta maternos poseedores de un repertorio reducido de especificidades, los que predominan en el tejido placentario.6,36 La presencia de moléculas HLA-G asociadas con membrana o solubles, parece inducir cambios en la secreción de citocinas por las células mononucleares periféricas hacia el patrón TH2, favorecedora del embarazo normal;37 y a su vez, la IL-10, citocina pertenece al perfil TH2, es capaz de activar la expresión de HLA-G.12 El aumento de la expresión de estas moléculas puede favorecer su reconocimiento por los linfocitos T gamma/delta maternos, y este hecho puede explicar la presencia de Acs anti trofoblasto hallados en el estudio. En todos los casos, los sueros reactivos con trofoblasto, presentaban especificidad HLA y ninguno de los casos con Acs específicos contra granulocitos exhibió reactividad con las células del trofoblasto. Teniendo en cuenta que estas células no expresan moléculas HLA clase I clásicas, podemos presumir que la reacción está dirigida contra antígenos HLA-G.
La reactividad con leucocitos y plaquetas desapareció en el 86,6 % de los sueros con Acs anti HLA, después de la adsorción con tejido trofoblástico y se mantuvo en todos los sueros con Acs de especificidad granulocitaria (tabla 2).
Los hallazgos del trabajo nos llevan a plantear la hipótesis de que la mayor parte de los Acs anti HLA detectados en el estudio en embarazadas entre las semanas 8 y 10, pueden estar dirigidos primariamente contra los Ags HLA del trofoblasto, y que su reacción con los Ags HLA presentes en leucocitos y plaquetas de sangre periférica puede deberse a un fenómeno de reacción cruzada. Otras 2 evidencias obtenidas de trabajos de otros autores ayudan a sustentar esta hipótesis:
- La mayoría de los investigadores afirman que la expresión de las moléculas HLA-G en las células del trofoblasto se inicia en una etapa muy temprana del primer trimestre del embarazo, incluso plantean que puede ocurrir en el estadio de blastocisto;2,3 por lo tanto, antes del inicio de la hematopoyesis embrionaria, capaz de generar respuesta inmune contra los Ags HLA paternos del feto.
- Los estudios de un grupo de investigadores de Harvard demostraron reacción cruzada de Acs entre antígenos HLA-A y HLA-G.38 La reacción cruzada se explica por la homología de la secuencia y estructura del gen HLA-G con la de los genes HLA clase I clásicos: tiene 8 exones, 7 intrones y la región 3'UTR; aunque a diferencia de aquellos, el HLA-G presenta un codón de parada en el exón 6 y muestra un polimorfismo bajo, con una limitada heterogeneidad de secuencias y pocos alelos.39
Los Acs anti HLA G, pudieran ejercer un efecto protector del embarazo, enmascarando otros antígenos trofoblásticos o cubriendo los receptores de los linfocitos T maternos, al reconocer por reacción cruzada a los Ags HLA leucocitarios.
Algunos estudios comunican una mayor frecuencia en la producción de anticuerpos bloqueadores en embarazos normales, lo que sugiere que estos pueden proteger al feto del aborto.17
En el aborto espontáneo, el fallo de la implantación en la fertilización in vitro y la pre-eclampsia, se han observado patrones de expresión de HLA-G aberrantes o disminuidos.9
Por último, algunos autores plantean que puede existir una débil expresión de moléculas HLA-C en las células del trofoblasto,35 lo que podría sustentar una hipótesis alternativa para explicar la reactividad de Acs anti HLA con células del trofoblasto. Sin embargo, la débil expresión de estas moléculas en el trofoblasto hacen poco probable esta opción. ]]>
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Recibido: 29 de diciembre del 2010.
Aprobado: 31 de marzo del 2011.
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Dra. María E. Alfonso-Valdés. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, Ciudad de La Habana, CP 10800, La Habana, Cuba. Tel (537) 643 8695, 8268, Fax (537) 644 2334. Correo electrónico: ihidir@hemato.sld.cu Website: http://www.sld.cu/sitios/ihi ]]>
