Palabras clave: HISTAMINA/administración y dosificación. DOSIFICACION LETAL MEDIANA. RATONES.
Los métodos para determinar la potencia relativa de drogas son ampliamente utilizados tanto en ensayos clínicos como en farmacología básica, en este último caso ya sea trabajando con órganos aislados o con animales totales.
La correcta interpretación de los resultados obtenidos con estos métodos requiere que las dosificaciones se formulen mediante unidades que reflejen la porción farmacológicamente activa o "masa activa" de las moléculas en estudio.1 Esto sin embargo, se incumple con mucha frecuencia. Así ocurre cuando se emplea el kilogramo o sus fracciones para indicar la cantidad de droga administrada o presente en un momento dado, como es habitual en los estudios in vivo y también relativamente frecuente en los estudios in vitro.
El objetivo del presente informe consistió en mostrar que para obtener la verdadera relación de potencia entre drogas la comparación debe realizarse siempre teniendo en cuenta la masa activa de éstas, para lo cual el procedimiento más sencillo consiste en expresar las dosificaciones en molaridad tanto in vitro como in vivo.
MATERIALES Y METODOS
EXPERIMENTOS IN VIVO
Se utilizaron ratones BALB-C machos, de 19 a 22 g de peso y alimentados con una dieta convencional, los cuales se colocaron en número de 8 a 10 por jaula. Su permanencia mínima en el laboratorio fue de 3 días antes de proceder a la administración de la droga. Se usó la vía intraperitoneal luego de someterlos a un ayuno de 3 horas, con agua ad libitum. La dosis para cada grupo de animales se ajustó a un volumen de 0,4 mL/20 g de ratón, disuelta en agua destilada. Se registró la mortalidad observada en las 48 horas siguientes. En total se emplearon 64 animales para la curva dosis-respuestas (CDR) del clorhidrato de histamina y 66 para la del fosfato. Se procedió de acuerdo con lo establecido en las buenas prácticas de laboratorio y código ético para el uso de animales de experimentación vigentes en nuestro país
Las dosis letales (DL) se determinaron según el método de Litchfield y Wilcoxon2 mediante un programa para microcomputadora elaborado al efecto.3 Los cálculos y comparaciones (linealidad, límites, paralelismo, potencia relativa) se realizaron conforme al método referido. La potencia relativa de las drogas se analizó utilizando, primeramente, las dosificaciones en mg/kg de ratón y, posteriormente, esas mismas dosificaciones en moles/kg de peso del animal. ]]>
EXPERIMENTOS IN VITROSe aislaron segmentos de íleon de cobayo (Dunkin-Hartley), machos, de 250 a 300 g de peso, mediante el procedimiento habitual.1 Las contracciones se registraron en un polígrafo multipropósito utilizando un transductor fuerza-desplazamiento. La capacidad del baño de órgano fue de 10 mL.
Se procedió conforme a una prueba de "los cuatro puntos", en la cual las drogas se administraron en volúmenes que fluctuaron entre 10 y 50 mL siguiendo un esquema de cuadrados latinos.1
La potencia relativa de las drogas se analizó utilizando, primeramente, las dosificaciones en mg/L de solución y, posteriormente, esas mismas dosificaciones expresadas en moles/L.
Tanto in vitro como in vivo se empleó diclorhidrato de histamina (BDH, lote 5030320H) y fosfato ácido de histamina (BDH, lote 2299280). Las soluciones nutricias se prepararon con agua destilada y reactivos convencionales (ENSUFARMA).
RESULTADOS
Las tablas 1 a 4 presentan los resultados obtenidos in vivo mediante el método de Litchfield y Wilcoxon. Además, tanto para el diclorhidrato como para el fosfato la relación dosis-efecto mostró una linealidad aceptable, así como un paralelismo entre dichas rectas, ambos análisis a una probabilidad del 5 %.
La tabla 5 presenta los resultados obtenidos in vitro mediante la prueba de "los cuatro puntos". Aquí también las rectas fueron paralelas entre sí a p = 0,05 en todos los casos.
Generalizando y resumiendo los resultados obtenidos in vivo e in vitro se observó que:
Las dosis letales observadas se corresponden en general con el rango de valores encontrados en la literatura aunque no coincidan exactamente la especie y/o la vía de administración utilizada.4
La discusión se centrará en los puntos señalados anteriormente, al resumir los resultados.
Alrededor del 60 % de la molécula del clorhidrato de histamina está constituida por la base, en tanto que en el fosfato sólo lo constituye el 36 % de la misma.5 Esto determina que, al tomar masas iguales de una y otra sal en las unidades habituales de kilogramo o sus fracciones, en el clorhidrato habrá casi 1,7 veces la porción farmacológicamente activa presente en el fosfato. En consecuencia, la comparación que se efectúe utilizando la dosificación expresada en dichas unidades de masa, que no reflejan este hecho, conducirá a conclusiones erróneas. Este razonamiento es válido tanto para los experimentos desarrollados in vivo como in vitro, tal cual puede apreciarse en la tabla 2 (in vivo) y la mitad izquierda de la tabla 5 (in vitro), donde se informa de una diferencia muy significativa en la actividad relativa de ambas drogas, lo que en nuestras condiciones experimentales no tiene sentido desde el punto de vista biológico.
En correspondencia con las ideas expuestas, otro fue el resultado que se obtuvo al efectuar los cálculos de la comparación tomando las dosificaciones en molaridad, que sí refleja la masa activa de las drogas en estudio. Como se puede observar en los resultados mostrados en la tabla 4 ( in vivo) y la mitad derecha de la tabla 5 (in vitro), cuando la comparación se realizó empleando las dosificaciones expresadas en molaridad no se obtuvo diferencia alguna en la potencia de las drogas comparadas, lo cual era presumible tratándose de la misma sustancia activa para ambas, en este caso la histamina en forma de base.
Resulta oportuno destacar que la 22ª Farmacopea Norteamericana6 establece que las concentraciones de las soluciones utilizadas en sus procedimientos se expresen en molaridad, molalidad o normalidad sin que exponga justificación alguna para ello y sin hacer referencia particular a las dosificaciones o concentraciones en los ensayos biológicos, mucho menos con el enfoque que se ha desarrollado en el presente informe.
Debe quedar claro que el empleo de las dosificaciones expresadas en molaridad no es la única solución del problema planteado. Cuando se comparen derivados de una misma base, como la histamina, por ejemplo, se prodrían usar satisfactoriamente las dosificaciones en miligramos de base. Pero ésto obviamente no funciona si se trata de bases diferentes pues el peso molecular de éstas es distinto. En tal caso se podría hacer la corrección de las masas expresadas en kilogramos o sus fracciones utilizando los pesos moleculares de las 2 drogas, lo cual sin embargo resulta engorroso, especialmente para calcular los límites del intervalo. Parece razonable entonces afirmar que la solución más sencilla y conveniente consiste en emplear la molaridad para formular las dosificaciones.
Es necesario señalar que, aun cuando al realizar la comparación se tomen en cuenta los pesos moleculares de las sales para una misma base activa, la interpretación de los resultados que se obtienen debe hacerse cuidadosamente ya que la potencia entre éstas pudieran diferir si la porción molecular acompañante introdujera variación desde el punto de vista farmacocinético o de otro tipo en el comportamiento de la molécula total, por ejemplo, en el acceso a la biofase del receptor o su afinidad por él. En el caso ejemplificado de la histamina la presencia de los átomos del fosfato o del clorhidrato no introdujo variación manifiesta en ese sentido, según se deduce de los resultados.
Sólo agregaremos, respecto al punto 2 del resumen de los resultados, que el paralelismo encontrado entre las CDR de ambas drogas apoya la idea de una forma similar de éstas para actuar, como era de esperar dado que la base activa es la misma en las 2 drogas. ]]>
La observación cuidadosa de las tablas 2 y 4 permite apreciar que hemos empleado 2 términos para referirnos al resultado de la comparación de potencia entre las drogas: "actividad relativa" cuando nos referimos al resultado en el cual se han tomado las dosificaciones en mg/kg y "potencia relativa" al referirnos a la comparación realizada utilizando la molaridad de las drogas, o sea, moles/kg, pues se trata de experimentos en animales enteros. Esta idea también está implícita en el contenido de la tabla 5 con relación a la concentra ción, ya que se trata de experimentos en tiras aisladas.Según lo informado en la presente comunicación, consideramos que se justifica diferenciar el empleo de estos 2 términos tanto in vivo como in vitro, y proponemos que se reserve la denominación de "potencia relativa" para el resultado que se obtenga cuando la comparación de la magnitud del efecto producido por 2 drogas se realice mediante dosificaciones cuya formulación exprese la porción farmacológicamente activa de las moléculas en estudio, lo que se logra del modo más racional utilizando la molaridad. Asimismo proponemos denominar "actividad relativa" al resultado que se obtenga cuando las unidades empleadas para expresar las dosificaciones no reflejen la masa activa de las drogas cuya intensidad de efecto se compara. Este puede ser el caso, por ejemplo, al trabajar con sustancias no bien definidas químicamente tales como extractos o productos aislados de plantas medicinales y aún no caracterizados.