Descriptores DeCS: VACUNAS CONTRA HEPATITIS B/inmunología; VACUNAS SINTETICAS; RATONES CONSANGUINEOS BALBc; ESTUDIANTES DE ENFERMERÍA; ESTUDIANTES DE MEDICINA; CUBA.
La hepatitis B es un problema de salud mundial, esta enfermedad es producida por un virus ADN, relacionado con varios virus de hepatitis animal conocidos como hepadnavirus.1 Su período de incubación es casi de 1 a 6 meses y se trasmite por vía parenteral, de forma vertical (madre-hijo) y horizontal, incluida la trasmisión sexual.
La infección por el virus de la hepatitis B (VHB) es causa de hepatitis crónica, con superinfección por el virus Delta, la cirrosis hepática, el carcinoma hepático y la muerte. Se estima que hay más de 300 000 000 de portadores crónicos de hepatitis B en todo el mundo y más de 10 000 000 en América Latina.1 En Cuba la prevalencia del antígeno de superficie del virus B (AgsHB) se estima que es de 1 % a partir de los resultados obtenidos en donantes de banco de sangre, por lo que deben existir más de 100 000 portadores de este virus.
El control de la enfermedad es posible con el uso apropiado de las vacunas contra la hepatitis B, pero desafortunadamente la mayoría de las infecciones que hoy día se reportan son en adultos que escapan a los programas tradicionales instituidos en los países que cuentan con la vacuna, como en el caso de los EE.UU.2
En 1986 la Administración de Drogas y Alimentos (FDA) de los EE.UU. licenció la primera vacuna de AgsHB obtenida por vía recombinante clonada y expresada en levadura,3 este fue el primer producto ADN recombinante autorizado para ser utilizado en seres humanos.
En Cuba se han dado pasos para el control y la eliminación de la hepatitis viral tipo B; uno de los aspectos desarrollados ha sido la producción de una vacuna contra el virus, cuya aplicación evita las patologías antes planteadas. La vacuna recombinante cubana expresa el fenotipo adw2 del AgsHB, utiliza como célula hospedera la levadura Pichia pastoris. Esta vacuna ha sido aplicada en el Programa Nacional de Inmunización, registrada y comercializada en otros países del mundo, después de los trabajos realizados por el grupo cubano en los 4 continentes mayores.4
El éxito de la vacunación en lo que respecta a la protección radica en que la respuesta sea intensa y duradera. El límite inferior de anti-AgsHB aceptado como protector es de 10 UI/L5 y los máximos niveles alcanzados después de terminado un esquema son predictores de la persistencia del anti-AgsHB, pues las cifras caen 6 veces entre los 9 y los 18 meses, y declina después de forma más lenta.6
Desde 1990, en que se comparó la inmunogenicidad de la vacuna cubana con una similar belga también obtenida por vía recombinante, se observó que la cubana tenía ventajas en cuanto a que se obtenían niveles de inmunoprotección (10 UI/L) e hiperrespuesta (100 UI/L ó más) superiores, mediante un esquema de 60 d, es decir 0-1-2 meses.7
En Cuba el documento sobre objetivos, propósitos y directrices para el año 2000 ha planteado la eliminación de esta enfermedad, al tener en cuenta las formas de transmisión muchas veces inaparente, el carácter asintomático de la inmensa mayoría de los reservorios,8,9 así como las distintas categorías de riesgo en los susceptibles (de exposición, evolución y diseminación) es necesario desarrollar modelos que permitan ser aplicados de forma sistemática o alternativa, además de permitir profundizar en los aspectos terapéuticos para no sólo evitar la aparición de nuevos reservorios sino eliminar los ya existentes. ]]>
El desarrollo de modelos experimentales no sólo va orientado hacia el mejor conocimiento de inmunogenicidad de la vacuna en términos preventivos, sino que existen reportes en la literatura de su utilización con fines terapéuticos sola o asociada con otros inmunomoduladores.10,11En los estudios en humanos, la selección de la población debe conllevar un beneficio final en cuanto a protección, por lo que, incluir jóvenes entre 17 y 21 años contribuiría a reducir la infección en un grupo considerado hace poco como de riesgo elevado.2 Si a esto le añadimos que ellos tendrán un riesgo profesional por estar vinculados con la esfera de la salud pública, el impacto de la inmunización se multiplica y le confiere mayor valor a la experiencia.
Considerando el costo-beneficio en la aplicación de estas vacunas, algunos investigadores han empleado la vía intradérmica (ID),12,13 o dosis menores del inmunógeno. (Díaz M, Bravo J, Rodríguez LL. Inmuno-reactogenicidad de la vacuna Heberbiovac HB, diferentes dosis. VII Congreso Panamericano de Infectología. Resúmenes de trabajos científicos. 1995. Cartagena de Indias. Colombia. P. 50)
El grupo de este trabajo ha desarrollado estudios con la utilización de la vía intradérmica (ID) en Venezuela14 y Brasil,15 pero en Cuba este tipo de trabajo no se había realizado, por lo que se considera oportuno evaluar en el medio cubano la utilización de esta vía de administración con la vacuna, Heberbiovac HB.
Tomando en consideración lo antes señalado en este trabajo, este equipo se propuso estudiar la inmunogenicidad de la vacuna Heberbiovac HB mediante distintas vías, dosis y esquemas de inoculación, con la finalidad de lograr nuevos modelos experimentales y aplicados al humano.
La dosis empleada fue de 1 mg por inóculo y las vías de administración fueron la intraperitoneal (IP) e intramuscular (UM), esta última se aplicó en el cuádricep derecho de cada animal. Los esquemas empleados fueron 0-1-2 semanas, 0-1-4 semanas y 0-4-8 semanas. El número de animales por grupo fue de 75.
La extracción de sangre total se le realizó a todos los animales por enucleación del globo ocular (Cosme K. Comunicación personal. CIGB, 1995), a los 15 d de terminar cada esquema. La sangre se centrifugó 5 min a 500 gravedades y el suero obtenido fue utilizado para la técnica analítica.
Como control positivo se utilizó un estándar secundario de 2 400 UI/L de la Behring, calibrado contra uno primario cedido por la OMS, y se realizó una curva con 5 puntos de dilución doble seriada a partir de 1 en 20. Como control negativo se empleó suero de ratones BALB/c no inoculados o suero humano sin marcadores del VHB.
Las muestras se corrieron puras, 1 en 10 y 1 en 100 diluidas en suero normal de ratón o de humano. La lectura se realizó a 492 nm en microlector de placa de la marca Organon Teknika. La sensibilidad del método osciló entre 5 y 7 UI/L, con un coeficiente de variación menor que 10 %.
La pendiente para la cuantificación se obtuvo en el rango de densidades ópticas entre 0,2 y 0,8 y donde se cumpliera el principio de linealidad tal como se ha desarrollado en el departamento de inmunología para cuantificación de AgsHB.17 (Izquierdo M. Validación de un sistema inmunoenzimático (ELISA) para la cuantificación del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B [AgsHB]. Biotecnología Habana 94. 1994. Vol.2. p. 42). ]]>
Se calculó el porcentaje de animales con seroconversión así como la media aritmética, y se calculó la diferencia entre éstos por la prueba t de Student y el coeficiente de variación: (DE/media aritmética x 100) en los grupos que hubo seroconversión en todos los animales. Para la variable cualitativa (seroconversión) se empleó la prueba de chi cuadrado (c2); se consideraron significativas aquellas diferencias que rebasaron los valores de la tabla p< 0,05.Criterios de inclusión: Jóvenes con un rango de edad entre 17 y 21 años, presuntamente sanos -se descartaron por interrogatorio: patologías degenerativas, metabólicas, infecciosas e inmunodeficiencias- que fuesen susceptibles a la infección y que no hubiesen estado en contacto con el virus (anti-AgsHB, ant-AgsHB y AgsHB negativos).
Criterios de exclusión: Individuos que hubieran sufrido hepatitis B, personas previamente inmunizadas contra la hepatitis B, alérgicos a algún componente de la vacuna, mujeres embarazadas o en período de lactancia, pacientes con diabetes, tuberculosis, enfermedades hepáticas, asma, y personas con tratamientos esteroideos.
Criterios de retiro del estudio: Sujetos que tuviesen presente en los estudios serológicos iniciales algunos de los marcadores del virus de hepatitis B, individuos que no cumplieran con el esquema completo de vacunación (el cual se evaluó 15 d después de la última dosis).
Se realizó extracción de sangre de la vena antecubital previa a la primera dosis para la evaluación serológica. En toda la intervención parenteral, tanto en la inoculación del inmunógeno como en la extracción sanguínea, se utilizó material estéril desechable.
Los grupos para los distintos esquemas y vías empleados quedaron integrados como aparece en la tabla 1.
| Esquemas | | |
| | ]]> IM | |
| 0-1-4 | | |
| 0-4-8 | | |
A los 15 d de culminados los esquemas se realizó extracción de sangre para la evaluación serológica, con el mismo método analítico descrito antes; se utilizaron el estándar y las diluciones de las muestras en iguales condiciones.
La evaluación de los resultados se realizó por medio de la seroprotección e hiperrespuesta, al considerar 10 UI/L o más y 100 UI/L o más de anticuerpo anti-AgsHB, respectivamente.5 El tratamiento estadístico se realizó mediante la prueba de chi cuadrado con el mismo nivel de significación referido antes (p<0,05).
A todos los participantes se les entregó una tarjeta para certificar las fechas, las vías de inoculación así como la cantidad de unidades internacionales por litro de anti-AgsHB posesquema. Los individuos que no quedaron seroprotegidos con el esquema que al azar le correspondió se le administró una dosis de refuerzo con 20 mg por vía intramuscular y se reevaluaron 15 d posdosis y se les entregó su tarjeta (anexo).
Los resultados de los 3 esquemas y vías empleados informados por medio de la seroconversión, media aritmética y coeficiente de variación, se expresan en la tabla 2. ]]>
TABLA 2. Resultados de inmunogenicidad al comparar 3 esquemas por vías intraperitoneal e intramuscular| Esquema | | | | |||
| | | | | ]]> IM | | |
| 0-1-2 | | | | | | |
| | | |||||
| 0-1-4 | ]]> 75/75 | | | | | |
| | | |||||
| 0-4-8 | | | ]]> 22 408 | | | |
| | | |||||
Como se observa, la seroconversión en el esquema 0-1-2 semanas fue de 35 % en la vía IM y 60 % para la vía IP, resultó significativa la diferencia c2 = 9,5. En el resto de los esquemas y vías en todos los animales hubo seroconversión. La media aritmética de actividad anti-AgsHB obtenida en los animales donde hubo seroconversión total (esquema 0-1-4 y 0-4-8 semanas) fue de 20 028 para la vía IP, esquema 0-4-8 semanas, y de 28 300 para la vía IM, esquema 0-1-4 semanas. Como puede observarse fueron superiores los niveles de anticuerpos de esta última aunque no hubo diferencia significativa entre ellas (p > 0,05). El mayor coeficiente de variación obtenido fue de 63 % para la vía IM, esquema 0-4-8 semanas y el menor de 40 % para la vía IP, esquema 0-1-4 semanas.
TABLA 3. Resultados de inmunogenicidad con el empleo de la vía Intramuscular, comparación de ambos esquemas
| ]]> Esquemas | ||||
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| Seroprotección | | | | |
| Hiperrespuesta | | | | ]]> 71 % |
Los valores obtenidos en seroprotección e hiperrespuesta en el esquema 0-1-4 semanas fueron de 75 y 9 % respectivamente y en el modelo 0-4-8 semanas fueron de 94 y 71 % respectivamente. Para ambas variables existen diferencias significativas a favor del esquema 0-4-8, c2 = 9,9 para seroprotección y c2 = 61 para hiperrespuesta.
| | ||||
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| Seroprotección | | ]]> 18 % | | |
| Hiperrespuesta | | | | |
Empleando la vía ID (tabla 4) los valores obtenidos en seroprotección e hiperrespuesta en el esquema 0-1-4 fueron de 18 y 4 % respectivamente y en el esquema 0-4-8 semanas fueron de 85 y 21 %. Existen diferencias significativas en seroprotección e hiperrespuesta entre los esquemas 0-1-4 y 0-4-8 semanas, c2 = 92 y c2 = 17,8 respectivamente.
Todos los participantes en el estudio quedaron seroprotegidos con el esquema inicialmente desarrollado o por la administración de una dosis de refuerzo. Las muestras de suero donde se detectó en la fase analítica seroprotección fueron recolectadas en un pool; se obtuvieron 200 mL con una actividad de 220 UI/L.
El esquema 0-4-8 semanas tiene valores de seroprotección similares a los obtenidos en este estudio en iguales condiciones, tanto en personas de este medio como de otros países no sólo del continente americano,19,20 sino también de Europa,21 África22 y de Asia.4
En el esquema 0-1-4 los valores obtenidos son discretamente superiores a los referidos por la literatura, en los que la respuesta se evaluó al mes del tercer inóculo.23 Si la evaluación se hubiese realizado en ese mismo intervalo de tiempo, los valores obtenidos aquí podrían ser aún mayores y quizás significativos. Esta sugerencia se basa en que en todas las comparaciones realizadas para la vacuna cubana con otras que existen en el mercado en esquemas cortos, la cubana siempre ha sido superior.24
Si se comparan los resultados de ambos esquemas por vía IM, se observa que existen diferencias significativas a favor del esquema 0-4-8 semanas tanto en seroprotección (c2 = 9,9) como en hiperrespuesta (c2 = 61). Estos resultados señalan que el esquema 0-1-4 semanas no tiene las condiciones necesarias para ser utilizado sistemáticamente y que sólo sería aplicable cuando exista alto riesgo de exposición no previsto en el tiempo, y considerar la posibilidad de emplear un refuerzo si no se obtienen los niveles deseados.
En los esquemas empleados para estas vacunas, clásicamente, existe una asimetría de tiempo entre la segunda y tercera dosis con respecto al intervalo entre la primera y la segunda (0-1-6 meses),25 esto sugiere que la diferenciació n en la dinámica de la respuesta inmune necesita un tiempo mayor que su inducción. Es probable que el factor limitante en función de l tiempo esté relacionado más bien con la diferenciación que con la inducción y que ello justifique los resultados obtenidos en este trabajo.
Los resultados de la aplicación de la vía intradérmica en el esquema 0-4-8 (tabla 4) se corresponden con lo esperado de acuerdo con los estudios realizados por este grupo de trabajo en Venezuela y Brasil; sin embargo, los bajos niveles de hiperrespuesta no hacen aconsejable esta vía de manera sistemática, pues desde el punto de vista técnico se pueden cometer errores y aplicar el inmunógeno en regiones apolares como es el tejido celular subcutáneo.
El esquema 0-1-4 semanas para ambas variables (seroprotección e hiperrespuesta) resulta significativamente inferior por lo que al igual que lo señalado en el caso de la vía IM no reúne las características para proponerlo.Las características numéricas y funcionales de las células presentadoras de antígeno en esta vía superan a la vía intramuscular;26,27 sin embargo, los resultados apoyan la hipótesis de que la dificultad en el esquema 0-1-4 semanas está relacionada con la diferenciación y no con la inducción; aspectos que quedan por demostrar y que se estudiarán en el análisis longitudinal con la membresía que participó en este estudio.
Los resultados obtenidos con el esquema 0-1-4 semanas y 0-4-8 semanas en seroprotección y en hiperrespuesta evidenciaron que la vía intramuscular superaba a la vía intradérmica, esto puede ser explicado si se tiene en cuenta que el inmunógeno empleado en este trabajo es dosis dependiente hasta 40 mg y que en la vía intradérmica se emplea 10 veces menor concentración que en la vía IM; es decir, que la ventaja teórica en cuanto a mejor presentación antigénica de la vía ID puede que no se haya evidenciado por efecto de la dosis del inmunógeno y del adyuvante.
La obtención de sueros tanto de origen murino como humano con actividad anti-AgsHB, permitirá el desarrollo de futuros trabajos tanto preparativos como analíticos. En este sentido, ya se está utilizando en el departamento, como sustitución del estándar comercial para la cuantificación de anti-AgsHB, el de origen humano, y ambos para el desarrollo de métodos confirmatorios.
Se concluye que los esquemas 0-1-4 y 0-4-8 semanas produjeron seroconversión en todos los animales; se obtuvieron con el esquema 0-1-2 semanas 35 y 60 % de seroconversión por la vía IM e IP, respectivamente. El coeficiente de variación menor se obtuvo con el esquema 0-1-4 vía IP; aun cuando los animales empleados fueron de la cepa BALB/c se detectó gran variabilidad en la respuesta. ]]>
La inmunogenicidad en humanos medida por medio de la seroprotección e hiperrespuesta es mayor en el esquema 0-4-8 semanas independientemente de la vía utilizada. El esquema 0-1-4 semanas cuando se utilice debe ser por vía IM y sólo seleccionado de forma excepcional. Todos los estudiantes de Medicina y Enfermería del ICBP "Victoria de Girón" quedaron con seroprotección contra el VHB.
Subject headings: HEPATITIS B VACCINES/immunology; VACCINES, SYNTHETIC; MICE INBRED BALBc; STUDENTS, NURSING; STUDENTS; MEDICAL; CUBA.